全国服务热线400-689-6719

最新研究成果

行业动态

联系我们

微生物平台

真菌菌丝的总RNA的提取

一.   服务介绍                           

        真菌菌丝的总RNA的提取

        酵母菌芽殖(budding)时,在良好的营养和生长条件下生长迅速,几乎所有的细胞上都长出芽体,而芽体上还可以形成新的芽体,于是就形成簇状细胞团。如果长大的子细胞不与母细胞分离,且其间的横隔面积与细胞直径相当,则可以将这种竹节状的细胞串称作真菌丝


二.实验试剂以及材料                     


      RNA提取缓冲液(CTAB):2% CTAB(W/V),2% 聚乙烯吡咯烷酮PVP(W/V),100 mM Tris-HCl(pH8.0,DEPC处理的水配置),25mM EDTA, 0.5g/L 亚精胺Spermidine,2.0M NaCl,2%巯基乙醇(V/V,使用前加入)。由于在高温灭菌条件下,Tris-HCl要和DEPC发生反应,所以配RNA提取缓冲液时直接用DEPC 处理的水配制即可。


SSTE:


       1 M NaCl,0.5% SDS(W/V),10 mM Tris-HCl pH8.0,1.0 mM EDTA


       10M LiCl 直接用蒸馏水配10M LiCl,加1‰的DEPC过夜后,高温灭菌。


        3M NaAc


        氯仿:异戊醇(24:1)


        酚(pH4.5):氯仿:异戊醇(25:24:1)


       DEPC处理水 用1‰的DEPC处理蒸馏水过夜,高温灭菌


       无水乙醇


       70%酒精


三.实验方法和步骤                       
        1. 实验开始前将RNA提取液于65℃水浴锅中预热,离心管中加入ME(巯基乙醇)(10mL加80ul,50mL中加入300ul)。


        2.取约0.8g菌丝体(液体培养获得的菌丝用真空抽滤即可!固体培养就更好说了),在液氮中迅速磨成精细粉末,装入50 mL离心管,按1g材料8mL的量加入预热的RNA提取液,颠倒混匀。


       3. 65℃水浴3-10 min,期间混匀2-3次


       4. 加入等体积的酚(注意是酸酚pH4.5):氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提(10,000 rpm,4℃,5 min)


       5. 取上清,等体积的氯仿:异戊醇(24:1)抽提(10,000 rpm,4℃,5 min)


       6. 加入1/4V体积10M LiCl溶液,4℃放置6hr以上(或过夜)


       7. 10,000 rpm,4℃离心20 min


       8. 弃上清,用500 ulSSTE溶解沉淀


       9. 酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提两次,氯仿:异戊醇(24:1)抽提1次(10,000 rpm,4℃,5 min)


       10. 加2V体积的无水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30 min以上


       11. 12,000 rpm,4℃离心20 min


       12. 弃上清。沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥


       13. 加200 ul的DEPC处理水溶解


       14. 用非变性琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计扫描检测RNA的质量


      (在抽提过程中,若蛋白质含量或其它的杂质还较多,可以增加抽提次数)


       注意:提取RNA请尽量在低温下操作,如果条件不容许,在室温下操作的时间要尽可能的短。


       (本文转载丁香通)


上一篇:VSVG假型逆转录病毒的生产
下一篇:噬菌体的分离步骤

东洪简介技术平台实验方法科研成果行业动态公司新闻

留言 / LEAVE A MESSAGE

联系我们 / CONTACT US

上海展辉生物技术有限公司
地址:上海市浦东新区东方路
联系电话:400-689-6719
联系邮箱:3369352092@qq.com
联系我们: 4006896719

关注我们 / FOCUS ON


扫一扫
关注东洪博元更多动态

Copyright 2012-2017 上海展辉生物技术有限公司 版权所有
关键词: 蛋白组学 流式细胞检测 动物造模 基因测序 基因敲除  western blot 透射电镜 免疫组化 原代细胞分离 载体构建 荧光定量PCR  技术支持:汉邦传媒 

沪ICP备17013725号-2