一.   服务介绍                           

       1975年，Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交细胞既可产生抗体，又可无限增殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。这一技术上的突破不仅为医学与生物学基础研究开创了新纪元，也为临床疾病的诊断、预防和治疗提供了新的方法。

1. 杂交瘤的基本原理：

        杂交瘤技术又称单克隆抗体技术(monoclonal antibody technique)。杂交瘤技术是使免疫动物的脾细胞在聚乙二醇（Polyethylene Glycol ，PEG）的诱导下与同系动物的骨髓瘤细胞融合。首先是细胞质融合，然后通过有丝分裂细胞核合而为一，形成新的杂交细胞，简称为杂交瘤。细胞融合后移入HAT培养液中培养。

       骨髓瘤细胞由于缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转化酶（HGRPT），在HAT培养液中不能增殖而死亡。淋巴细胞培养中也不能长期在培养液中生长增殖。然而杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了HGPRT的基因产物，并从骨髓瘤细胞中获得肿瘤细胞不断生长繁殖（传代）的特性，因此在HAT培养液中选择性存活下来。细胞融合后既具有产生特异性抗体的能力。又保留了瘤细胞能体外长期培养的特性。

二.实验方法                             

 杂交瘤细胞制备：

       （2）免疫小鼠：选用8～12周龄雌性BALC/C小鼠免疫。如抗原为可溶性（蛋白质），可按每只鼠一次剂量为10～100μg/只免疫。蛋白质抗原与等量弗氏完全佐剂充分混匀，分别注入鼠的颈背部多处或腹腔内，间隔2～4周同法重复，经1月后，再用10～100μg（0.1～0.2ml）抗原作静脉或腹腔加强免疫。

       细胞与微生物表面抗原一般具有较高的免疫原性，可不加佐剂，直接经腹腔或静脉注入（1～2）×107细胞。一般采用融合前3～4d大剂量静脉注入抗原，然后取脾做融合实验。因此间脾脏B淋巴母细胞-浆细胞比例较高，融合率较高。

      （3）脾细胞制备：

       ①放血处死小鼠，浸泡在75%的酒精中消毒。

       ②在无菌条件下取脾，至含培养液的小平皿内，去掉脂肪和结缔组织，用5ml无血清培养液冲洗一次。

       ③将脾细胞置细胞网上，加入5ml不完全培养液。用注射器内芯研磨分散脾细胞，将脾细胞收集到离心管内（50ml），加10～20ml培养液，离心（800～1000r／min，10min），弃上清后计数备用。

      （4）饲养细胞制备：在体外培养时，单个或少数分散的细胞不容易存活与繁殖，必须在加入其他活细胞才易存活与繁殖。通常在融合的前一天或当天用取小鼠腹腔巨噬细胞制作饲养层细胞。

       （5）细胞融合（杂交）

三.实验步骤                             

杂交瘤细胞瘤细胞的选择性培养

培养：

       将融合后的细胞悬浮于HAT培养液中，置于含5%～7% CO2，37℃饱和湿度培养箱中培养。

 换液：

       每2～3天更换一半量的培养液一次，在融合两周内使用HAT培养液，在第12～13天用HT培养液，在第14天后根据细胞增殖情况改用15%～20%FCS完全培养液。

观察：

       经融合剂PEG处理后的细胞，凝集成粗颗粒状。当天用倒置显微镜观察，可见2～5个粘连骨髓瘤细胞，常有融合的巨细胞或哑铃状的细胞。

 杂交瘤细胞的筛选：

        融合后的细胞在HAT培养基培养后，即有部分培养孔出现杂交瘤细胞集落，而其中仅部分是分泌预定特异性抗体的杂交瘤细胞。因此在培养7～10 

 杂交瘤细胞的克隆化：

       细胞融合成功后，并经证实培养孔中存在预定抗原特异性抗体时，应尽早将杂交瘤细胞克隆化，其目的是利用单个细胞培养技术，从细胞群体中选育出遗传稳定而同源的细胞系，以获得分泌单一抗体的杂交瘤细胞系，淘汰遗传不稳定的杂交瘤细胞。

       每个杂交瘤细胞含有来自两种亲本细胞全套染色体，但在杂交瘤增殖过程中，将逐渐丢失染色体，甚而导致McAb产生能力的消失。因此，在筛选抗体阳性的杂交瘤细胞时，须尽早进行克隆化，以保持杂交瘤细胞具有同源的子代。克隆化多采用有限稀释法。

 单克隆抗体腹水的制备：

       培养上清液中抗体含量低且混有大量血清蛋白，而腹水中虽然抗体含量高，但也混有蛋白，需进行纯化及鉴定其特性。 

       单克隆抗体技术

       (本文来源丁香通）