一.   服务介绍                           

背景及原理：

       细胞中存在着能分解磷酸酯的酶，其中最主要的是磷酸酯酶。这类酶按最适PH可分为两类：1.PH在9.5左右的条件下发挥作用，称为碱性磷酸酶；另一类在PH5.0左右的条件下发挥作用，称为酸性磷酸酶。当酸性磷酸酶与其底物作用时，能水解磷酸酯使其释放出磷酸基，磷酸基进而与溶液中存在的铅盐结合形成无色的磷酸氢铅沉淀物，当用黄色的硫酸铵作用该沉淀时可形成黄棕色或棕黑色的硫化铅沉淀，从而确定细胞中酸性磷酸酶所处的部位。

       酸性磷酸酶广泛分布于集体各种组织细胞内，主要存在于细胞的溶酶体内，常作为溶酶体的标志酶，此外，还存在于内质网和细胞质内。当细胞中核算和蛋白质代谢活动增加时，酸性磷酸酶活性增强。酸性磷酸酶还参与脂类代谢。因此，它在疾病、免疫反应和细胞损伤与修复过程中具有一定的生物学意义。

       1 取20g左右小白鼠一只，每日向其腹腔注射6%淀粉肉汤1ml，连续3d。

       2 在第三次注射后4和，向腹腔注射生理盐水1ml。

       3 颈椎脱臼法处死小鼠后，打开腹腔，用注射器（不装针头）直接吸取腹腔液。

       4 向预冷的盖玻片上滴一滴腹腔液，立即用牙签图后放入小培养皿4℃冰箱中30min，使细胞自行铺展开。

       5 冷风吹干玻片。

       6 多聚甲醛固定30min。

       7 PBS冲洗。

       8 向盖玻片上滴加酸性磷酸酶工作液，37℃，30min。

       9 蒸馏水洗净，吸去多余水分。

       10 放入2%硫化铵溶液中处理5min，蒸馏水洗净。

       11 封片

       12 镜检。

       13 对照实验：将腹腔涂片置50℃温育30min使酶灭活，再进行6-12步同样的实验。

三.实验步骤                             

以新鲜动物组织为材料对细胞中酸性磷酸酶的定位

实验方法与步骤:

       1 动物新鲜组织低温恒冷切片，片厚6μm，冷丙酮固定10min。

       2 把切片置于酸性磷酸酶工作液中（预热至37℃），37℃处理0.5-1h。

       3 蒸馏水洗3次，每次1min。

       4 1%冰乙酸液处理3min。

       5 蒸馏水浸洗2次，每次1min。

       6 2%硫化铵液处理3-5min。

       7 流水冲洗数分钟，蒸馏水洗3遍。

       8 用1:30的吉姆萨染液染色15min。

       9 封片

       10 镜检

细胞中酸性磷酸酶的定位

注意事项：

       1 孵育液必须现配先用。

       2 当铅离子浓度过低时，产生的磷酸离子不能完全被结合而发生弥散，并可进入细胞核，会造成染色假阳性。

       3 孵育时间过长也可能发生酶扩散和细胞核染色现象。

       细胞中酸性磷酸酶的定位实验

       （本文来源丁香通）