一.   服务介绍                      

       目前，感受态细胞的制备常用冰预冷的CaCl2处理细菌的方法制备，即用低渗CaCl2溶液在低温（0℃）时处理快速生长的细菌，从而获得感受态细菌。此时细菌膨胀成球形，外源DNA分子在此条件下易形成抗DNA酶的羟基－钙磷酸复合物粘附在细菌表面，通过热激作用促进细胞对DNA的吸收。转化效率可达106－107转化子/微克DNA。

  二.实验方法                                          

操作：

       1、取－70℃冰冻菌种，用划线法接种细菌于培养皿，做好标记，于37℃培养过夜。

       2、第二天，从平板上挑取单个菌落，接种至含有3ml LB培养液的试管中，37℃振荡培养过夜。次日取菌液1ml接种至含有100ml LB培养基的500ml烧瓶中，370C剧烈震荡培养约2~3小时（200~300r/min）

       3、当菌落600nm OD值达到0.3－0.4时，将烧瓶取出放置冰上10~15分钟。在无菌条件下把菌液倒入50ml离心管中。4℃,4000g离心10分钟。

       4、弃上清，将管倒置于干滤纸上1min，吸干残留的培养液。加10ml 0.1M的CaCl2到离心管中，振荡混匀，悬浮菌体，冰浴30分钟。

       5、4℃,4000g离心10分钟，弃上清，将管倒置于干滤纸上1min，吸干残留的培养液.加4ml冰预冷的0.1M的CaCl2，重悬浮菌体。每管0.2ml分装，至4℃保存备用，24－48小时内使用效果较好。如果暂时不用，可再保存于－70℃的低温冰箱中。

感受态细胞的制备

       1．  （7-10天以内的平板）取保存的菌接种于LB固体培养基， 37°C培养过夜(不超过16h)

       2．  挑取单菌落至5mlLB液体培养基，37°C，200rpm培养过夜

       3．  按1：100（可以1：200或更多）取1ml培养菌液转入100ml LB液体培养基中，37C，250rpm培养至OD600=0.3至0.4，立刻置于冰上，10 分钟(严格冰上操作，轻柔，避免较大的振荡)。

       4．  4000rpm离心5min（JA-20，beckman），去上清，加入2.5ml 0.1M MgSO4（或MgCl2） 溶液，悬浮沉淀，冰浴15min

       5．  4000rpm离心5min，去上清，加入2.5ml 0.1M CaCl2及15%甘油（建议细菌浓度更高），悬浮沉淀。

       6．  以每管200ul分装，-70C保存备用（可以液氮速冻）

       7．  以标准质粒确定感受态细胞的转化率

       取质粒5ul（2ng/ul）与50ul新鲜配制的1×SSC:0.1mol/l CaCl2(体积比1：2；1×SSC含0.15mol/L NaCl和15mmol/L 柠檬酸钠，pH7.0)于冰上放置90s，加入100ul DH5α感受体，冰上放置5min；42°C热休克2min后，迅速放回冰上1min，取所有转化混合物均匀铺于LB平板（含100ug/ml的Amp,可以在37°C预热），37°C12-16小时.

       感受态细胞制备原理

       （本文来源丁香通）