PCNA步骤跟一般的免疫组化步骤基本一样：

1、脱蜡、水化

       1)  60 ℃×20 min→Xylene 2 ×10 minutes；

       2)  100% absolute ethanol：2 ×5 minutes；

       3)  95% ethanol 2 minutes；

       4)  80% ethanol 2 minutes；

       5)  70% ethanol 2 minutes；

       6)  PBS洗3次×3 min

       7）封闭内源性过氧化物酶： 3%的过氧化氢，室温封闭10min

       8)  PBS溶液洗3次×3 min。

2、抗原修复暴露抗原决定族

       10)  切片放入0.01 M柠檬酸钠缓冲溶液（pH6.0）后，在微波炉里高火4 min至沸腾后，再加热约6 min×4次，每次间隔补足液体，防止干片。

3、封闭非特异性蛋白

       11)  PBS溶液洗3次×3 min；

       12)  将切片取出,周围水分用滤纸吸干,用组化笔在组织周围画上圈,在圆圈内组织滴入5%羊血清（与二抗来源一致）后放入湿盒中,室温30（10～30）min；

4、一抗孵育

       13)  甩去切片上的羊血清,用滤纸擦干组织周围残留血清，直接加入已稀释的一抗后，放入湿盒中室温1小时，然后4度过夜，从冰箱中取出需37 ℃复温45 min。

5、二抗孵育

       14)  将一抗倒掉并用PBS洗5 min×5次；

       15)  用滤纸将圆圈周围的水吸去，加入已稀释的二抗后放入37 ℃恒温烤箱中30 min（回收）。

       16)  用PBS洗5次×5 min；

6、SP反应

       17)  加入SP后放入37度烤箱中30 min。

       18)  用PBS洗5次×5 min；

7、显色

       19)  加入DAB（快速滴入，观察染色情况，倒掉染液），显色时间控制在约5 min（3～10 min），由镜下观察颜色控制时间。

8、复染、脱水、透明、封片

       20)  用PBS 3次×3min后，用双蒸水洗5 min；

       21)  加一大滴苏木素染液，胞核蛋白染几秒，胞浆或胞膜蛋白染20 s后自来水冲洗，双蒸水洗5 min，再用PBS返蓝5 min。

       22)  脱水：

       100% absolute ethanol: (1-2) min。

       23)  透明：Xylene 1×(1-2) min→Xylene 2×(1-2) min