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基因枪活体植物基因转染

本实验所用基因传递系统(基因枪)原理:

 

       低压基因递送系统(GDS-80 基因枪  U.S. Patent Number: 6,436,709 B1),根据火箭喷嘴原理和空气动力学原理设计,是用于传递生物微粒进入靶细胞的一种新型系统。如图1中所示,当左侧出现输入气体压力时(如:氦气),两个腔室之间将形成巨大的压力差,一旦该气体穿过装载样品的咽喉处,GDS-80 中的气体输出将为生物粒子提供足够的动能量,使它们加速到接近超音速的速度(约 300m/s)。在加速过程中,样品溶液会雾化并均匀地喷洒到靶向目标的表面上。





影响转染效率的因素:
 

       在执行 GDS-80 轰击的同时,有四个主要因素影响转染效率。涉及火箭喷嘴设计原理方面,有两个:传递压力的设定和枪管的直径。


       通过增加输送压力的设定,可以使两个腔室中的压力差变大,从而增加生物微粒的速度,增加动能;而增大枪管直径会降低微粒的输出速度。传递距离也在实验中起到重要的作用,通过增加从枪管到目标样品的传递距离,生物颗粒将受空气阻力影响而减慢速度,不过这样也同时降低了损坏靶细胞的几率。


       最后一个因素是传送样品的总量,被传送的样品量越大,越够能提高转染效率。 然而,调整输送距离和传递压力是几个因素中最重要的,枪管大小和输送样品量应该保持在一个恒定数值,这样更容易修正实验。

 
活体植物实验:
 
       针对植物细胞的基因组研究,现在已经通过使用很多不同的策略而被广泛开展。无论这些研究的主要目的是什么,这些研究成果终究是需要应用于活体植物的研究中来。将基因转染到活体植物方面之前存在很多障碍,比如如何维持无微生物的环境,如何保护植物本身组织的脆弱性,如何设定传递压力的大小,甚至是植物处于什么生长状况都是需要考虑的方面。通过使用 GDS-80 系统,Wealtec 公司为基因转染活体植物这项实验提供了最便捷的方法。
 
       通过调节传递压力和距离,GDS-80 可将生物微粒成功转染到活体植物的植物细胞中。
 
材料:
 

       烟草叶和藜属植物


       低压基因递送系统:GDS-80 (Wealtec)


       通用目标间隔器,UTS-10 (Wealtec)


       质粒 DNA:以绿色荧光蛋白(GFP)报告性基因构建的病毒 DNA。


       MaestroTM 活体成像系统。
 

操作步骤:


       1. 在进行实验前,至少培养样品 30 天,这样确能保叶片大于 5×6 cm2。


       2. 根据以下步骤制备 DNA-金粉混合液:


       a. 将金粉微粒中加入充足的无菌蒸馏水。


       b. 使用 100% 乙醇对金粉微粒进行三次洗涤并弃去浮层。


       c. 加蒸馏水使金粉微粒重新悬浮。


       d. 将准备好的 DNA 溶液(1μg/μl)添加到金粉微粒溶液中,形成浓度为 1 μg  DNA / 0.6 mg 金粉微粒悬浊液。


       e. 剧烈摇晃微离心管使得样品混合均匀。


       f. 滴入适当体积的 0.1M 亚精胺和 2.5M  CaCl2 进入试管,同时不断剧烈地摇晃。


      g. 继续摇晃一分钟以上。


      h. 用 100%EtOH 进行三次洗涤,并弃去浮层。


      i. 重新使DNA包裹的金粒子悬浮于100% 的 EtOH 中。


     3. 按照说明书中要求的,讲 UTS-10 安装到 GDS-80 系统上,并设置 40-50 psi 的传递压力。


     4. 调整距离量尺至 6-8 cm 的传递距离。


     5. 把四爪叶片夹夹到目标叶上,用手调螺栓将其拧紧固定。


     6. 将等分10μl DNA混匀悬浊液倒入样品装载孔中。


     7. 对叶片标本进行轰击。


     8. 培育植株三天以上,通过使用 CRi MaestroTM 的体内成像系统观察荧光结果


       (本文转载丁香通)

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