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分子生物学技术miRNA

PAT法分析mRNA

实验方法原理


       PAT法 [ PCR poly(A) test ] 可以快速、灵敏地从总 RNA 中分析特异 mRNA,而且可以定量估算 RNA poly(A) 尾长度。这方法中,包括 cDNA 合成的整个操作过程都在一个反应管中完成,不仅操作更简便,也减少了可能存在的 RNase 污染。


       尤其是 PAT cDNA 合成后非常稳定,并可重复使用,该方法的易操作性及灵敏度使其可以在任何系统中分析 poly(A) 尾的长度,目前已成功应用于鼠卵母细胞、果蝇卵母细胞和肝胎、线虫、酵母及培养细胞中 poly(A) 的分析。


实验材料


       T4 DNA连接酶   无 RNase H SuperscriptⅡ反转录酶   寡聚(dT)锚引物   mRNA特异引物


试剂、试剂盒


       蒸馏水   Superscript Ⅱ RT缓冲液   DTT   ATP   dNTP   Taq DNA聚合酶   Taq DNA聚合酶缓冲液


实验步骤


一、材料与设备


       1. PAT cDNA 制备


       (1) DEPC 处理蒸馏水。


       (2) 高浓度T4 DNA 连接酶(10 Weiss U/L)。


       (3) 无 RNase H Superscript Ⅱ 反转录酶(RT) ( Life Technologies,Gairhersburg,MD,USA ) ( 200 U/μl ).


       (4) 5 X Superscript Ⅱ RT 缓冲液。


       (5) 0.1 mol/L DTT,DEPC 水配制。


       (6) 10 mmol/L ATP,DEPC 水配制。


       (7) 40 mmoI/L dNTP ( 10 mmol/L dATP、10 mmol/L dTTP、10 mmol/L dCTP、10 mmol/L dGTP),DEPO-H2O 配制。


       (8) p[dT]12-18注意寡[dT]12-18必须被磷酸化 ],10 ng/μl。


       (9) 寡聚(dT ) 锚引物(5'-GCG AGC TCC GCG GCC GCG T12)200 ng/μl ( 也可以使用其他 3' 端具有寡聚 dT 延伸(n>10 ) 并且 5' 富含 GC 的寡核背酸作为 PCR 引物),DEPC 水配制,所有上述酶及溶液均保存于 -20℃ 。


2. PCR 反应


       (1) 40 mmol/L dNTP ( 10 mmol/L dATP、10 mmol/L dTTP、10 mmol/L dCTP、10 mmol/L dGTP),DEPC 水配制。


       (2) 寡聚(dT ) 锚引物 200 ng/μl 水配制。


       (3) mRNA 特异引物,溶于蒸馏水。


       (4) Taq DNA 聚合酶。


       (5) 10X Taq DNA 聚合酶缓冲液。


二、操作方法


1. PAT cDNA 制备


       (1) 从组织或细胞中提取总 RNA 溶于 DEPC 水中,取 5 μl 加入无 RNase 的微量离心管中。


       (2) 加入 2 μl (20 ng) p[dT]12-18 至每个 RNA 样品中,RNA 和 p[dT]12-18 的总体积为 7 μl。


       (3) 加热到 65℃,变性 5~10 min。


       (4) 立即将反应管置于 42°C 水浴中,注意动作要迅速,以避免 p[dT]12-18 与最未端 poly(A) 尾退火。


       (5) 加入 13 μl 预热至 42°C 的 下列混合物,用吸头吹打混匀,置 42℃ 孵育 30 min。对于所有 PAT 反应,预先混合所有相同组分,对于每一个反应,应加入:4 μl 5X Superscript II RT 缓冲液,2 μl 0.1 mol/L DTT,1 μl 40 mmol/L dNTP 混合物,1 μl 10 mmol/L ATP, 4 μl DEPC 处理水,1 μl T4 DNA 连接酶 10 Weiss U/μl。


       (6) 孵育后,反成物仍保温于 42℃ ,加入 1 μl (200 ng ) 寡聚(dT) 锚引物。混匀,快速离心,12℃ 孵育 2 h。


       (7) 将反应管置于 42℃ 孵育 2min。


       (8) 加入 1 μl 无 RNase H Superscript II 反转录酶,混匀,置于 42°C 孵育 1 h。


       (9) 加热 20 min,使反转录酶和连接酶失活,PAT cDNA 可根据需要进行稀释。


2. PCR 反应


       (1) 25~50 μl 标准反应体系包括:1X 缓冲液 [ 50 mmol/L KCl,10 mol/L Tris-HCl ( 25°C 时 pH 9.0 ),0.1% Triton X-100,1.5 mmol/L MgCl2 ],0.2 mmol/L dNTP,0.5 μmol/L 模板特异引物,0.5 μmol/L 寡聚(dT) 锚引物,0.5~1.0 U Taq DMA 聚合酶, 0.5~1.0 μl PAT cDNA 作为模板。


       (2) 扩增 500 bp 长片段建议使用的循环条件:93°C 变性 5 min,93°C 变件 30 s,57~65°C 复性 1 min,72℃ 延伸 1 min,最后 72°C 延伸 7 min。


       (3) 可以取一小部分扩增产物,利用限制性内切核酸酶完全消化分析 3' 末端。


       (4) 用凝胶电泳分析扩增产物。


       (本文转载丁香通)

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