全国服务热线400-689-6719

最新研究成果

行业动态

联系我们

分子生物学技术miRNA

呼吸道合胞病毒空斑实验方法汇总

       传统的空斑实验方法测呼吸道合胞病毒的PFU值,由于其空斑形成较小,且需要借助特异性的表面融合蛋白抗体来确定,故操作繁琐,费用较高。这里介绍给大家三种简单易行的空斑形成实验操作方法:

中洪博元实验

       1、以5×10e5/ml的密度接种Hep-2细胞到6孔板中,每孔加入3ml细胞悬液;


       2、待细胞长成单层后(不得超过48hr),移去营养液,每孔加入400ul的PBS和100ul毒液(10倍系列稀释);


       
3、37℃,5%CO2,吸附1-4h,每隔15-30分钟应摇晃板子1次以令病毒分布均匀,病毒在4h时达到最高吸附度;

 

       4、弃去吸附液,每孔添加覆盖层3ml,少于3ml细胞不易存活。覆盖层以含5%小牛血清的2×DMEM和0.6%的琼脂糖按1:1比例混合而成,这样小牛血清的终浓度为2.5%,琼脂糖为0.3%。琼脂糖必须高压灭菌,用前以微波炉充分融解,并放置65℃水浴保温待用。


        2×DMEM即取1袋干粉DMEM加入500ml去离子水融解即可,其中还可加入双抗或二性霉素等,过滤除菌备用,用时37℃预热。二者应充分混合且温度不能过高(即无烫手感为止),否则会摧残细胞;


       
5、37℃孵育6-7天,到时每孔添加约2ml的1%福尔马林(以0.15M的NaCl配制),固定过夜使之充分渗透过覆盖层。固定时间24h以上,无上限;

 

       6、剔除覆盖层,用自来水轻柔的冲洗平板边缘残留的琼脂糖;


       
7、每孔添加2-3ml的0.05%中性红。贮存液为10×的,可保存数月之久,工作液以去离子水稀释即可;


       
8、室温染色1h-1d,吸掉染液,轻柔地清洗并打开盖子令其干燥后即可保存数年之久;


       
9、空斑计算方法同其它方法。


       1、以5×10e5/ml密度接种Hela细胞于12孔板中,每孔1ml,使之24h内能长成单层;

 

       2、以2%DMEM(维持液)10倍系列稀释好毒液;

 

       3、吸去生长液,PBS洗涤细胞1-2次,每孔加入维持液500ul;

 

       4、每孔加入稀释好的毒液50ul,充分混匀,每个稀释度做2个复孔,37℃,5%CO2吸附2h,每隔5分钟摇晃1次平板,以使之分布均匀; 

 

       5、微波炉充分融化无菌的3%琼脂糖,65度水浴保温备用,4%的2×DMEM预热至37℃;取1个小培养瓶,分别加入等体积的琼脂糖和DMEM,充分混合至温度适合时每孔加入混合液1ml;


       
6、室温或4℃放置板子致覆盖层完全凝固,然后将之反扣过来,置37度培养4-5天,每天观察细胞情况,注意保证培养箱内有保湿的蒸馏水,否则琼脂糖易干裂;


       
7、取出板子,每孔加入100ul的MTT,37℃孵育4h,则可见清晰的空斑形成,活细胞染成蓝色,选择空斑不融合且分散单个的空斑计数计算pfu值即可。MTT即塞唑兰,100mlDDW加入250mg配成0.25%浓度,-20℃冻存备用;


       8、PFU计算方法同其它方法。


       1、试验前一天用2×105HEP22细胞接种24孔板。37℃,5%CO2培育过夜。Hanks液冲洗细胞1~2次,用NaHCO3调Eagle MEM的pH值后稀释RSV(10倍稀释) ,然后加入24孔板中(设2个复孔),吸附1~2h,15~30min摇动一次以保证蚀斑分布均匀;


       2、以2倍的Eagle内加青链霉素、卡那霉素、碳酸氢钠、琼脂糖配成琼脂覆盖层;

 

       3、倒出病毒液,加入琼脂覆盖层0.5ml ,冷凝后,倒置于34℃,5d后,用福尔马林固定,0.15 %结晶紫染色,显微镜下数斑;


       4、PFU=a1b/v( PFU指每ml病毒样品空斑形成单位,a指空斑均数,b指病毒稀释度的倒数,v指病毒量);

中洪博元生物

       (本文转载丁香园)


上一篇:PAT法分析mRNA
下一篇:Northern blot

东洪简介技术平台实验方法科研成果行业动态公司新闻

留言 / LEAVE A MESSAGE

联系我们 / CONTACT US

上海展辉生物技术有限公司
地址:上海市浦东新区东方路
联系电话:400-689-6719
联系邮箱:809207521@qq.com
联系我们: 4006896719

关注我们 / FOCUS ON


扫一扫
关注东洪博元更多动态

Copyright 2012-2017 上海展辉生物技术有限公司 版权所有
关键词: 蛋白组学 流式细胞检测 动物造模 基因测序 基因敲除  western blot 透射电镜 免疫组化 原代细胞分离 载体构建 荧光定量PCR  技术支持:汉邦传媒 

沪ICP备17013725号-2