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原位PCR技术详解,你知多少?

原位PCR简介

原位PCR技术的基本原理,就是将PCR技术的高效扩增与原位杂交的细胞定位结合起来,从而在组织细胞原位检测单拷贝或低拷贝的特定的DNARNA序列。 

 

原位PCR技术成功地将PCR技术和原位杂交技术结合起来,保持了两项技术的优势又弥补了各自的不足。原位PCR技术的待检标本一般先经化学固定,以保持组织细胞的良好形态结构。细胞膜和核膜均具有一定的通透性,当进行PCR扩增时,各种成分,如引物,DNA聚合酶,核苷酸等均可进入细胞内或细胞核内,以固定在细胞内或细胞核内的RNADNA为模板,于原位进行扩增。扩增的产物一般分子较大,或互相交织,不易穿过细胞膜或在膜内外弥散,从而被保留在原位。这样原有的细胞内单拷贝或低拷贝的特定DNARNA序列在原位以呈指数极扩增,扩增的产物就很容易被原位杂交技术检查。 

 

基本类型

根据在扩增反应中所用的三磷酸核苷原料或引物是否标记,原位PCR技术可分为直接法和间接法两大类,此外,还有反转录原位PCR技术等。

 

引物设计

1、直接法原位PCR技术 

直接法原位PCR技术是将扩增的产物直接携带标记分子,即使用标记的三磷酸腺苷或引物片断。当标本进行PCR扩增时,标记的分子就掺入到扩增的产物中,显示标记物,就能将特定的DNARNA在标本(原位)中显现出来。 
常用的标记物有放射性同位素35S,生物素和地高辛,用放射性自显影的方法或用亲和组织化学及免疫组织化学的方法去显示标记物所在位置。 

 

2、间接法原位PCR技术 

间接法原位PCR技术师现在细胞内进行特定DNARNA扩增,再用标记的探针进行原位杂交,明显提高了特异性,是目前应用最为广泛的原位PCR技术。 

 

3、原位反转录PCR技术

原位反转录PCR(in situ reverse transcription PCR, In Situ RT-PCR)是将液相的RT-PCR技术应用到组织细胞标本中的一种新技术,与RT-PCR(液相)不同点在于,进行原位反转录PCR反应之前,组织标本要先用DNA酶处理,以破坏组织中的DNA酶,这样才能保证扩增的模板是从mRNA反转录合成的cDNA,而不是细胞中原有的DNA。其它基本步骤与液相的RT-PCR相似。

 

类型

直接法

间接法

优点

操作简便,流程短,省时

特异性较高,扩增效率也较高

缺点

特异性较差,易出现假阳性,扩增效率也较低,特别是在石蜡切片上

操作步骤较直接法繁琐

不同之处

间接法原位PCR与直接法不同的是,反应体系与常规PCR相同,所用的引物或三磷酸腺苷均不带任何标记物。

 

原位PCR技术的应用 

原位PCR技术能在组织细胞原位检测出拷贝数较低的特异性基因序列。按照待测基因的性质,可将原位PCR的应用分为检测外源性基因和内源性基因两方面。 


       1、用于外源性基因的检测:病毒基因的检测、细菌基因的检测 、导进基因的检测 
 
       2 用于内源性基因的检测:异常基因的检测、固有基因的检测 

 

基本步骤

包括标本制备、预处理、原位扩增(PCR)、后处理和原位检测等。具体详情步骤,明日我们继续讲解。

 

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