表观遗传研究显示，某些等位基因表达呈现genomic imprinting，也有一些属于random X inactivation。Genomic imprinting的存在导致个体只表达非imprinting一方的表型，也就是说如果爸爸的某个位点的基因被imprinting，那么只有妈妈的这一位点基因表达。Random X inactivation出现在雌性哺乳动物体内，由于存在两个X染色体，雌性动物细胞内会随机失活一条X染色体基因的表达，这种失活状态将贯穿细胞生命的始终且在其子代细胞中同样保持失活状态。随着表观遗传学的深入研究，人们发现genomic imprinting只在小鼠和人的不到200个常染色体基因中存在，这提示在常染色体中大部分父亲和母亲来源的等位基因表达的机会仍然一半一半。但事实上，常染色体的表观遗传等位基因特异表达（Autosomal, epigenetic allele-specific expression (ASE)）效应显现出单等位基因效应（monoallelic），例如抗原受体，嗅觉受体等。而这些单等位基因效应经单细胞转录组研究表明，很少像randome X inactivation那样是随机发生的。所以问题就来了——既非imprinting，又不是随机（random）发生的，那么究竟是什么决定了我们表达爸爸还是妈妈的等位基因呢？

        遗传学和精神病学家Christopher Gregg等人多年来一直致力于脑组织细胞内等位基因的表观遗传研究，并于2015年和2017年先后在《Cell》子刊《Cell Reports》和《Neuron》上发表了两篇文献[1, 2]，描述小鼠不同脑区细胞内等位基因的表达趋势，包括非典型imprinting，单等位基因（monoallelic），双等位基因（biallelic）等表达模式。并针对那些在鼠，猕猴和人脑内保守的非遗传性等位基因表达模式与精神系统疾病的相关性进行了研究。

       通过对基因组学和RNA测序的大量数据分析，Gregg团队得到了很多不同脑区细胞内单等位基因和双等位基因表达的数据；那么在真实的脑组织中，这些等位基因在对应的细胞内是否真的呈现相应的表达模式呢？为了直观地观察数据统计得到的结果，Gregg等人通过RNAscope技术针对等位基因的转录进行了原位检测，实现了多年来首次原位对等位基因的转录进行研究。

       我们来看一下Gregg是怎样实现这个实验设计的：

       通过特异性针对等位基因上转录出的nascent RNA的内含子（intron）进行探针设计。由于RNAscope技术只检测RNA而非基因组DNA，故intron probe可以检测等位基因被转录出来后存在较短时间内的nascent RNA，而当nascent RNA被修饰后，内含子部分被剪切掉，成熟的RNA进入到胞浆或者在细胞核内行使其相应的功能。正是由于nascent RNA被转录出来后只短时间内聚集在细胞核内，故通过intron probe可以直接观察到位于细胞核内，相距较远的两个等位基因转录出的nascent RNA。理论上，当只有一个等位基因被转录时，细胞核内可以观察到单簇nascent RNA聚集成的信号点；而当双等位基因都发生转录时，细胞核内可以观察到两簇nascent RNA聚集成的信号点。  

       Gregg等人的实验结果显示通过这一方法确实可以在细胞核内原位检测单等位基因表达和双等位基因表达。

       RNAscope技术是由美国Bio-techne旗下Advanced Cell Diagnostics(ACD)公司研发的RNA原位杂交产品，在近年来的生物检测领域发展迅速。与传统的RNA原位杂交相比，RNAscope技术属于新一代RNA原位杂交技术，其特异性的双Z探针设计避免了传统长链RNA探针的弊端，配以自身级联放大检测原理，可以高效敏感地检测到目标RNA。该技术优势如下：

       1. 应用广泛: 使用RNAscope技术，靶点RNA为大于等于300个碱基的特异序列，即可进行探针设计。因而RNAscope技术可以应用于几乎所有物种，所有组织以及所有基因的检测。

       2. 特异性：RNAscope独特的双Z（ZZ） 探针设计有效的防止了探针的非特异性结合，同时降低了背景干扰。由于结合在非特异性位点的单个的Z 探针不会产生完整的信号放大分子结合位点，并会在杂交过程中被洗脱掉，从而防止非特异性信号的放大，使得探针的信号具有高度特异性。探针设计合成需要2~4周时间即可完成。

       3. 灵敏度：RNAscope方法检测每个RNA 分子时，只需三对双Z（ZZ）探针即可完成杂交和信号可视化。

       4. 单分子可视化和单细胞定量: 使用RNAscope技术杂交上三对及以上双Z 探针即可在标准的显微镜下呈现可观察到的点状信号。ACD公司提供的分析软件更可以定量每一个单细胞内RNA 的表达水平。

       5. 兼容降解的RNA: 由于RNAscope三对双Z探针即可检测到目标RNA，而通常针对靶点RNA设计的探针为20 对双Z 探针，因而即使目标RNA发生部分降解，仍可以稳定有效地检测到靶点RNA。

       6. 检测结果稳定一致性：由于工业化合成RNAscope技术用到的探针以及所有检测试剂，且该技术针对不同样本类型（冰冻切片， 石蜡切片，悬浮细胞，贴壁细胞等）已经有成熟的实验操作流程，故使得RNAscope技术检测结果具有稳定性和一致性。除了可以在实验室进行手工操作外，该产品也可以在Leica以及罗氏Ventana自动平台上运行，为结果的一致性和稳定性提供了可靠的依据。

       7. 多通道多靶点同时检测：由于RNAscope技术可以同时进行多通道探针杂交以及信号放大，故在可见光检测中可以在同一张切片上同时检测两个靶点；而在荧光检测过程中，可以在同一张切片上检测三个或三个以上靶点RNA。

       （本文转载生物谷）