常规转基因载体的基本结构包括：①启动子，用于驱动转基因的转录和后期表达；②拟插入的靶基因cDNA序列，包含有要表达肽段的编码序列；③cDNA非翻译区(untranslated region，UTR)和3'端加多聚腺苷酸尾巴(polyadenylation，polyA)；④质粒复制所需的DNA骨架序列。通常，为了避免供需双方因为长期得不到转基因动物而导致相互指责，在进行转基因载体制备之初，一定要咨询制备转基因小鼠的技术人员，以确定如何构建转基因载体以及如何剪切与纯化质粒。

近年来，为了能精确控制外源基因编码序列的高表达，除了要在转基因载体中保留上述组件外，在载体设计中还可引入各种附加DNA序列，比如内含子(intron)、基质附着区(MARs)、绝缘子(insulator)、内部核糖体进入位点序列(internal ribosome entry site，IRES)、E2A框以及Kozak序列等。进一步地，为了能提高转基因小鼠的筛选效率，或者为了便于对转基因在组织和细胞中的表达进行示踪，在转基因载体设计中还使用了各种报告基因，如氯霉素乙酰转移酶基因（cat）、荧光酶基因(luc)、各种荧光蛋白（如绿色荧光蛋白GFP、YFP等）、β-半乳糖苷酶基因(Lac Z)、碱性磷酸酶基因、生物传感器（如钙或cAMP传感器）以及用于细胞系敲除的基因（如白喉毒素及甲型流感病毒的M2蛋白的突变体）等。

最后，在制备转基因小鼠前，除了要认真考虑在载体中要使用组成元件外，还要提前考虑引入一些方便基因整合检测所用的DNA序列，以便当获得founder之后，能方便地检测到已整合的转基因序列并快捷地捕获外源基因表达的表型特征等。对潜在的转基因Founder的筛选，包括检测外源基因的是否存在，是否整合及基因转录和相应蛋白活性水平等。