【 摘要】 目的 研究茶碱对微波所致小鼠记忆障碍的影响。 方法 ①将小鼠按 0 ,5 ,10 ,25 ,50 mW/ cm2微波辐射剂量分组后分别接受辐射 20 min ,并记录动物辐射前后的肛温。 采用被动回避避暗实验 ,记录小鼠完成训练所需次数以及 24 h 后测试潜伏期作为评价其学习记忆的指标。 ② 在假微波辐射或 50 mW/ cm2 微波辐射前 30 min 腹腔注射生理盐水或茶碱 ,再测试小鼠的学习记忆能力。 结果 ① 与对照组比较 ,50 mW/cm2 微波辐射小鼠可引起动物记忆获得以及记忆保持障碍 ,同时也引起小鼠体温升高 (P<0.01或P<0.05) 。 ② 茶碱 + 50 mW/cm2 微波辐射组的小鼠其学习记忆能力明显好于生理盐水 + 50 mW/ cm2 组 (P <0.01) 。 结论 实验结果提示 : ①微波热效应是引起认知障碍的主要因素。 ② 茶碱可改善微波诱发的小鼠记忆障碍 ,提示内源性腺苷介导微波的损伤效应。

微波辐射可损害人类和动物的认知能力 。 急性或长期动物实验均表明微波能够破坏动物学习记忆等脑的高级活动。 一般认为 ,微波辐射所产生的热是微波效应的主要因素。 当脑组织吸收微波能量后 ,由于局部加热使脑组织代谢活动加速 ,干扰脑组织的正 常 能 量 代 谢。 腺 苷 作 为 腺 苷 三 磷 酸(adenosine trip hosp hate , A TP) 的代谢产物 ,是一种重要的应激信使和内稳态调节物质。 多种病理因素如缺血 、高温 、缺氧 、电刺激等均会刺激脑内腺苷大量释放 。 这些因素可导致机体能量需求增加或能量代谢底物缺乏,从而使组织能量供应不足 。 从微波热效应角度出发 ,我们推测微波辐射有可能也会激活体内腺苷代谢通路而导致机体功能障碍 。 为此 ,本实验拟首先采用避暗实验考察微波所诱发的小鼠学习记忆障碍 ,并研究腺苷受体的非特异拮抗剂 ( 茶 碱) 对 微 波 辐 射 效 应 的 影 响 , 以 评 价 体 内腺苷代谢通路在微波所致动物记忆障碍中的可能作用。

材料与方法

一、动物及试剂

雄性昆明小鼠 ,体重 20～24 g ,共 120 只 ,由本单位实验动物中心提供 。 茶碱 ( t heop hylline) 购于Sigma 公司 ,临用前用生理盐水配置成所需浓度。

二、方法

1.微波源及辐射方式 :频率为 2860 M Hz 的脉冲微波源 。 辐射时将小鼠置于有机辐射盒内 ,以上端方形号角喇叭辐射全身。 微波辐射的平均功率密度在 5 mW/cm2～100 mW/cm2 范围内连续可调 。假辐射组小鼠作同样处理 ,但不激活微波源。

2.小鼠被动回避避暗实验 :检测系统为两个相通的等大的明室和暗室(20cm×10cm ×10cm) ,明室用LED灯照明 ,暗室底为铁栅栏结构 ,接通电流可对进入的动物施以电击 。训练时将小鼠放在明室内。 当小鼠进入暗室后通以电流刺激 ,电刺激后立即取出小鼠放回明室进行下一次实验 ,直到小鼠在明室停留的时间超过60s ,记录小鼠完成训练所需次数。 24h 后进行记忆保持测试 ,将小鼠再次置于明室内 ,记录小鼠身体全部进入暗室所需的潜伏期 ,潜伏期终止时间定为 300s。

3.分组及实验处理 :小鼠随机分为 11 组 ,每组10 只 ,分组如下 : ① 微波辐射组 :动物按微波辐射剂量大小分为0、5 、10 、25和50mW/cm2 共5组 。 辐射持续时间为 20 min,使用电子温度计 (天津今明仪 器 有 限 公 司 ) 记 录 动 物 辐 射 前 后 肛温 。0mW/cm2 组即为假微 波辐 射组 ( sham exposure group) ,作为对照组。 辐射结束立即开始行为学实验。 ② 茶碱干预组 : 辐射方 法同前 , 辐 射剂量 为50 mW/cm2 ,于辐射前30min 腹腔注射茶碱 。 动物分6组 ,分别为“ 假微波辐射 + 生理盐水组”、 “假微波辐射+12.5 mg/kg 茶碱组”、“假微波辐射 +25mg/kg茶碱组”、 “微波辐射 + 生理盐水组”、 “ 微波辐 射+12.5mg/kg 茶 碱 组 ”、“微波辐射 +25mg/kg茶碱组”。

三、统计学处理

实验数据以 x ±s 形式表示 。 采用 SPSS 统计软件 ,以 Kruskal2Wallis 非参数单因素方差分析对不同组数据进行显著性检验 , P<0.05 提示具有显著差异 , P<0.01 提示具有非常显著差异 。

结果

一、微波对小鼠的记忆能力的影响避暗实验训练时 ,小鼠每进入一次暗室便施以一次电击 。 小鼠建立情景与恐惧之间的联系越快 ,受到的电击次数就越少 ,反映其记忆获得能力越强 。训练前的微波辐射可导致小鼠避暗实验记忆获得能力的下降 (表 1) ,与假微波辐射组完成训练所需次数相比 ,5 mW/ cm2 、10 mW/ cm2 微波辐射后小鼠的行为无显著变化 ( P > 0.05) 。 25 mW/ cm2 组小鼠完成训练的次数虽高于假辐射组 ,但无统计学差异。 50 mW/ cm2 微波辐射后 ,小鼠完成训练所需次数与假微波辐射组相比明显增加 ( P < 0.01) 。

小鼠避暗实验完成后 ,次日测试其从明室进入暗室的潜伏期。 潜伏期越长 ,表明其记忆保持能力越强。 Kruskal2Wallis 单向方差分析检验发现 ,微波辐射可依赖性地损害小鼠的记忆保持能力 (表1) 。 与 假 微 波 辐 射 组 相 比 , 从 接 受 辐 射 剂 量25 mW/ cm2开始 ,小鼠的潜伏期出现了一定程度的下降 ,但是统计学上差异并不显著 ,而 50 mW/ cm2微波辐射则明显地降低了小鼠记忆保持的潜伏期( P < 0.01) 。 本实验训练时采用反复训练方法 ,微波辐射后动物虽然完成训练的次数不同 ,但是都达到了同样的标准 ,60 s 内不再进入暗室 ,因此潜伏期的长短能够体现动物记忆巩固能力的差异。 实验结果表明较高剂量的微波辐射对动物记忆获得与巩固两个过程均有破坏作用 。

辐射结束后采用电子温度计测定小鼠肛温 。50 mW/ cm2 组小鼠肛温出现明显升高 ,25 mW/ cm2组有轻微升高 ,而对照 、5 mW/ cm2 、10 mW/ cm2 组体温无变化 (表 2) ,说明高剂量的微波辐射不仅损害动物记忆 ,同时也引起动物体温升高 。

二、茶碱对微波所致的小鼠记忆损害的影响

茶碱是腺苷受体A1和A2的非特异的拮抗剂 。本实 验 中 选 用 茶 碱 剂 量分别为12.5mg/kg 与25mg/kg。 动物给药后30min 时 ,以50mW/cm2 的平均功率密度微波辐射 ,然后进行避暗实验训练 。与 “ 假微波辐射 + 生理盐水组”小鼠完成训练次数相比“ , 假微波辐射 + 茶碱组”小鼠行为无变化 ,而微波辐射组小鼠所需的训练次数显著增加 (P<0.01) 。“ 微波辐射 + 茶碱组”小鼠训练次数与假辐射组相比无明显变化 ,与 “ 微波辐射组 + 生理盐水组”相比则显著性减少 (P<0.01) (表 3) ,提示给予茶碱后 ,微波辐射不再损害小鼠的获得性训练 ,即茶碱可以阻断微波对记忆获得的损害效应 。

在记忆保持能力方面 ,从小鼠次日的记忆保持实验成绩可以看出 (表3) “ , 微波辐射 + 生理盐水组”潜伏期成绩与 “ 假微波辐射 + 生理盐水组”相比显著下降 (P<0.01) “ , 微波辐射+25mg/kg 茶碱组”潜伏期成绩与 “ 微波辐射 + 生理盐水组”相比有较大提高 ,虽然两者之间无统计学差异 ,但是 “ 微波辐射+25 mg/ kg 茶碱组”潜伏期成绩不仅与 “ 假微波辐射 + 25 mg/ kg 茶碱组”相比无明显差异 ,甚至与 “ 假微波辐射 + 生理盐水组”相比差异也不显著 ,提示茶碱可减轻微波所致记忆保持障碍。

结论

一、微波对动物认知的损害

由于神经系统的特殊敏感性 ,微波对脑高级活动的损害引起了公众以及科研人员的广泛关注 。 本实验发现 ,高剂量微波辐射后 ,小鼠记忆能力出现障碍的同时 ,核心温度上升达 2 ℃以上 ,而没有明显改变动物体温的低剂量微波则未对动物学习记忆能力产生显著影响。 本实验结果与 Mickley 等的结论相似 ,支持微波热效应是导致动物认知障碍主要的因素 ,即当动物吸收微波辐射的能量超过自身体温调节能力后 ,可产生有害的组织加热反应 ,从而导致动物行为的改变。 值得一提的是近年来有一些研究认为 ,在极低剂量的微波辐射下 ,动物的某些涉及到辨别、知觉等复杂的行为表现发生了改变 ,强调微波损伤的 “ 非热效应”,然而这些实验由于难以得到很好的重复验证 ,缺乏足够的说服力 。 美国电气和电子工程师协会发布的白皮书中也认为 ,脑吸收微波能量后辐射导致的组织加热 ,几乎可以解释所有已知微波所致的动物行为变化的研究结果。

二、腺苷在微波效应中发挥的作用

脑吸收微波的能量后 ,局部加热可加快神经元代谢 ,在供能物质一定的情况下 ,可导致 A TP 消耗增加 ,神经元处于相对缺能状态。 在腺苷酸激酶和 5’2核苷酸酶的作用下 ,ATP 的微弱变化就可引起胞外其代谢产物2腺苷浓度极大的变化 。 在组织能量供应不足时 ,作为一种普遍性的代谢应激信使 ,腺苷分泌能力通常会大为增强。 微波辐射所引起的组织加热可能也会刺激腺苷的大量释放 ,以降低脑的代谢活动 ,从而平衡能量供求关系。 过度释放的腺苷可激活腺苷受体 A1、A2(A2A和A2B) 以及A3 ,调节脑学习记忆等认知活动 ,因此腺苷可能参与了微波所致认知障碍效应。 为了验证该假说 ,本研究在对动物微波辐射之前使用低剂量茶碱进行干预 ,结果发现与辐射组相比“ , 微波辐射 + 茶碱组”小鼠记忆获得成绩显著提高 ,显示茶碱可以阻断微波对记忆获得的损害。 虽然 “ 微波辐射 + 25mg/kg 茶碱组”动物与 “ 微波辐射 + 生理盐水组”动物之间潜伏期的比较无统计学差异 ,但是 25mg/kg 茶碱可较大幅度地提高微波辐射后动物记忆保持成绩 ,以至与假微波辐射组之间无统计学差异 。 与已有研究一致的是 ,本实验中使用的茶碱剂量对于小鼠避暗实验获得与保持没有影响 。 目前认为低剂量茶碱最主要的效应是阻断腺苷受体,因此这些结果提示微波辐射可能会激活腺苷代谢系统 ,而腺苷则可能通过腺苷受体调节神经元活性 ,从而影响动物的学习记忆活动。

腺苷对学习记忆活动的调控通常有两条相对比较重要的路径 :一为间接途径 ,通过A1受体 ,抑制中脑和前脑胆碱能神经元活性,调节动物的唤醒状态 ,维持动物的注意力 ,而警戒性和唤醒对于动物认知任务的完成是至关重要的。 另一条为直接途径 ,腺苷可调节海马等区域突触的可塑性,而后者则被认为是学习记忆的物质基础。 由于记忆获得需要动物注意的保持与适度的警觉 ,而记忆的巩固则依赖于海马等区域的可塑性,因此腺苷可能通过调制脑不同区域神经元的活性 ,参与微波所致的动物学习记忆障碍。 值得强调的是 ,我们发现茶碱并没有完全阻断微波对记忆巩固的损害 ,这表明腺苷代谢通路可能是微波作用途径之一。 由于微波效应与学习记忆机制都十分复杂 ,根据微波频率 、辐射强度和辐射方法的不同 ,所影响到脑的区域与认知活动都会有很大变化 ,因此腺苷参与的变化过程需要进一步深入研究 。