摘要：防腐剂苯扎氯铵（BAC）在眼科溶液中的应用非常普遍，尽管它有可能加剧干眼症（DED）。对角膜上皮的影响尚在研究中。已经评估了BAC用于DED小鼠模型的作用，但对对角膜缘上皮细胞的影响的研究仍未深入。我们的研究旨在全面评估不同BAC给药方案的影响及其作为DED小鼠模型的适用性。

方法：C57BL/6J小鼠（n=72）局部接受BAC（0.05–0.2%）超过7天。应用荧光素染色、角膜平滑指数和免疫组织学分析来确定BAC治疗后眼表的结构和细胞变化。使用形态学和功能分析检查了BAC（0.0001-0.01％）对培养的原代小鼠角膜上皮细胞（CLEC）（n = 6）的影响。

结果：0.2％BAC导致严重的角膜上皮缺损，而0.1％BAC在7天内每天使用一次，可诱导点状荧光素染色而不损害角膜平滑度。组织化学染色显示基底角膜上皮细胞排列紊乱，胞质晕增大。PAS+杯状细胞减少。BAC处理也调节K14在角膜缘的表达和分布。在培养的CLEC中，BAC引起细胞收缩和空泡化，使LDH释放增加，细胞坏死增加4.1倍。 BAC的浓度低至0.0001％会降低菌落形成。

结论：本研究描述了C57BL/6小鼠暴露于BAC后，如何诱发人类出现的DED的一些临床病理特征，从而为探讨其对眼表，尤其是角膜上皮及其干细胞的影响提供了基础。

简介：干眼症（DED）是一种多因素的疾病，其病因很多，既有外在因素（如生活方式和环境），也有内在因素（如自身免疫）。DED包括一种或多种泪液成分的功能障碍，导致泪膜不稳定，以及无法保护和维持眼表和导致慢性炎症。眼部刺激，刺痛和异物感是患者经常报告的症状，使用含有防腐剂（如苯扎氯铵（BAC））的局部滴眼剂会使病情恶化。BAC是一种季铵阳离子，广泛用于保存眼科制剂，有两个主要用途。首先，它作为一种表面活性剂将离子组分溶解到其他不相容的溶剂中。这促进了药物的有效乳化和稳定，因此延长了保质期。 其次，BAC在抑制微生物活性方面优于其他防腐剂。近年来，BAC成为研究动物模型中DED发病机理的药物。 兔试验显示，在4-14天中每天两次局部应用0.1％BAC，导致DED的发展。小鼠试验显示，0.2%的BAC每天两次的应用会触发DED的临床症状，包括荧光素染色增加、角膜不规则和结膜杯状细胞（GCs）丢失。大多数研究BAC的小鼠研究都是BALB / c品系，但是观察到了品系特异性反应。

值得注意的是，以更高的频率使用> 0.2％的BAC时会出现严重的眼表疾病（例如角膜缘干细胞缺乏症）。尚不清楚DED动物模型中眼表对BAC的反应机制。尽管研究人员已经检查了该模型的角膜上皮细胞，但是关于它对角膜缘上皮细胞（CLECs）影响的信息很少。当然，已经在多种物种中研究了BAC对培养的角膜和结膜细胞的毒性作用。BAC诱导细胞损伤和凋亡，抑制细胞迁移。有趣的是，低浓度BAC会导致DNA链断裂和线粒体功能障碍。此外，在新外用药物的监管批准程序中进行的细胞毒性试验，通常不以反映眼药水持续多次使用的方式进行。因此，这些测试无法筛查长期暴露下的累积毒性。研究人员使用各种体外和体内方法研究DED的过程中，记录了细胞增殖，凋亡，屏障功能和GC数量的变化，但是否影响角膜缘上皮细胞的细节披露很少。因此，我们推测急性BAC暴露会给CLEC动态带来短暂的改变。本文发现0.1％BAC诱导上皮损伤，类似于C57BL / 6小鼠中DED的特征，包括角膜通透性增加，GC损失和角膜上皮应激。此外，BAC刺激角膜中央和外周上皮细胞增殖，并使角蛋白14（K14）+细胞从角膜缘向周围角膜移动。 将原代小鼠CLEC暴露于BAC会引起细胞坏死和干细胞功能丧失。

小鼠干眼症模型：使用异氟烷将7-8周龄的雌性C57BL / 6小鼠（n = 48）固定15秒，并局部以5μl液滴的形式将BAC注入右眼 连续7天通过微量移液器进行给药，每天一次或在每天两次。随机分为4组，分别为0%（PBS对照组）、0.05%、0.1%和0.2%BAC。左眼未经治疗。 一旦在雌性小鼠中发现了具有类似DED特征的BAC浓度，便以相同的浓度对7-8周龄的雄性小鼠（n = 12）进行给予BAC。

荧光素渗透性和角膜光滑度：腹腔注射氯胺酮和二甲苯嗪（分别为100 mg/kg和10 mg/kg）麻醉小鼠，然后滴入1μl 0.1%荧光素钠。小鼠被手动眨三下眼睛来分配染料，然后闭上眼睛，去掉多余的染料。用钴蓝滤光片，用尼康FS-3眼科裂隙灯对每只眼睛进行检查和成像。将角膜图像分为五个部分（鼻部、颞部、上部、下部和中部），每个部分都使用之前经过验证的小鼠评分系统进行评分。0=无染色，1=轻微点状染色，2=明显点状或轻微合并染色，3=明显合并或轻微斑片状染色，4=明显斑片状染色。图像由一名实验者和两名独立的观察者评分。 角膜平滑度是使用先前公布的方法以定义的5点量表确定的。

组织学和形态计量学评价：对小鼠连续给药BAC7天后，对小鼠实施安乐死，将包括角膜，结膜和眼睑的眼表全部切除，固定在10％福尔马林中，并石蜡包埋以进行切片。从三个指定位置收集矢状切面（5μm），每个位置间隔约200μm，以横向方向覆盖眼表。用H&E和PAS染色代表性切片，观察和评价GC形态和数量。通过计数结膜上皮内的PAS +细胞来测量GC密度。用配备Olympus DP73数码相机的Olympus BX51显微镜拍摄图像，然后使用适当的软件对其进行分析。

免疫荧光染色：切片在Tris缓冲盐水（TBS，pH 7.6）中平衡20分钟，在TBS中用0.1 M甘氨酸淬火30分钟，然后在室温下用20%山羊或兔血清室温下封闭1小时。将切片从封闭溶液中取出与一抗（在TBS-B中稀释）在4°C孵育过夜。以预定浓度使用一抗。兔和山羊IgG，或不使用一抗作为试剂阴性对照。 然后将切片用TBS冲洗，并与Alexa Fluor偶联的二抗反应1小时。将载玻片安装在含有DAPI的ProLongGold®防褪色材料上，并在配备DP73数码相机的Olympus BX51上成像。

原代CLECs细胞培养及BAC的诱导效果：如前所述，小鼠原代细胞在规定的无血清角质形成细胞培养基中增殖。将CLECs以3×104细胞/孔的密度接种于24孔培养板中，然后在生长培养基中培养至融合，然后去除培养基，用PBS冲洗细胞三次。将BAC在KSFM（200μl/孔）中以10倍极限稀释度（0.1％，0.01％，0.001％和0.0001％）稀释10分钟，将细胞用PBS洗涤三次，并24h替换一次培养基（无BAC） 。使用EVOS-FL倒置显微镜捕获图像。在一些实验中，收集条件培养基以检测LDH含量以确定细胞毒性。部分细胞经annexin V和碘化丙啶染色，流式细胞仪检测细胞凋亡。

结果：BAC诱导的小鼠角膜上皮细胞的临床变化：在指定的时间点，对小鼠的眼睛用荧光素钠染色，然后用裂隙灯显微镜成像。在基线时对角膜上皮进行缺陷分级后，每天一次0％（PBS对照），0.05％和0.1％BAC组的小鼠无明显差异，而接受0.2％BAC的小鼠的基线值略低于对照组。在第4天和第7天，与对照组相比，滴注0.05％BAC后染色也没有明显增加。 有趣的是，从第4天到第7天，给予0.1％和0.2％BAC组中的荧光素吸收水平下降。但是，在第7天与对照组相比，给予0.1％和0.2％的BAC后，荧光素的摄取显着增加。在第7天，检查眼睛的角膜平滑度，其中BAC与对照组相比无明显差异。此外，荧光素染色或角膜平滑度无性别相关差异。