简介：全世界约有200万人患有关节炎。全关节置换通常是终末治疗，但是植入物的寿命是一个问题，超过一半的感染者年龄小于65岁。关节软骨损伤会导致早期关节炎。由于关节软骨的无血管性质及其对损伤的无效反应，关节软骨在较大缺陷中的愈合潜力有限。一些厚度的损伤不能愈合，仅刺激细胞复制和基质形成对相邻软骨全层损伤的最小反应，但是穿透软骨下骨可导致正常的愈合反应。它发生了，但最终软骨缺损。纤维软骨的张力与正常的透明软骨的张力相反，并且可以承受压力。因此，迫切需要有效的生物愈合和软骨再生方法以预防早期关节炎。有多种手术方法可以治疗骨软骨损伤。尽管已经促进了骨髓刺激和表面置换的技术，但是它们在解决大缺陷和产生透明软骨方面受到限制。自体软骨细胞移植（ACI）受到关注。细胞生长需要两个步骤和实验室支持。功能性组织工程学是增强组织再生的一种新方法，从生物力学，生化和形态学的角度看，它具有产生组织以及组织的潜力。在绵羊中进行的临床前研究旨在评估自体软骨细胞纤维蛋白植入物在模拟临床应用中的性能。但是，它有其自身的局限性。软骨细胞的纤维蛋白结构太软，无法独立锚固在缺损中。从技术上讲，使用骨膜贴片将植入物固定在缺损处。人们已经寻求用于修复或重建骨软骨缺损的新的，更可靠的技术。具有更好的综合特性以及不需要自体或异体骨软骨移植的生化和机械特性的复合材料的开发是有吸引力的。钽是一种具有优异生物相容性和耐腐蚀性的金属元素，由于其低弹性模量和低摩擦性能而被广泛应用于整形外科领域。它还具有高连通性，孔隙率和出色的骨骼生长特性。在这项研究中，使用多孔钽中的软骨细胞和纤维蛋白作为细胞载体的支架，体外构建软骨。

材料和方法：棕褐色制备：钽支架直径为10毫米，厚度为0.5毫米。软骨细胞的制备：将两只2个月大，重2至2.3kg的新西兰白兔用作实验动物。在采血之前处死动物，并用过量的苯巴比妥获得自体血浆和血清。无菌技术用于从膝盖，髋部和骨关节表面获得全厚度的软骨。将软骨与软骨膜分离，切成小块，并用含有100μ/ ml青霉素和100μ/ ml链霉素的Dulbecco磷酸盐缓冲液洗涤。最后，再次用DPBS洗涤样品。在37°C，用0.3％胶原酶消化软骨90分钟。将样品离心（500×G）10分钟以获得细胞沉淀。除去上清液，并用15ml DPBS洗涤粒细胞以除去残留的酶。离心样品10分钟以获得最终的颗粒细胞。将分离的软骨细胞接种在6孔培养板中（Ham's F12和Dulbecco's改良培养基1：1 + 1％抗坏血酸+ 10％自体血清+抗菌/抗真菌+ 1％谷氨酰胺）。放入37°C，5％CO2的培养箱中，每3天更换一次培养基。用0.125％胰蛋白酶EDTA消化原代培养物。将细胞沉淀物在密度为5000细胞/ cm 2的175 cm 2培养瓶中培养。每天在倒置显微镜下观察软骨细胞的形态特征。融合后，将细胞用胰蛋白酶消化，并在放置钽之前与血浆混合。加入氯化钙溶液后纤维蛋白聚合。移植前培养的细胞的纤维蛋白钽结构保持3天。将其在6个培养皿中培养，并置于二氧化碳培养箱中。植入：手术中使用无菌技术，镇静和麻醉，根据体重在肌肉内施用氯胺酮，甲苯噻嗪和舒尔泰等药物。在裸鼠的背部进行手术切口，并在背部的左侧和右侧植入两个结构。缝合皮肤。 4周后处死三只小鼠，8周后处死另外三只小鼠。

组织学和生化鉴定：收获软骨用于组织学和生化鉴定。将它们在10％福尔马林中于4°C固定24小时，通过标准组织学技术处理，最后包埋在石蜡中。根据标准程序，将组织切片（5μm厚）用HE和阿尔辛蓝染色。生化评估，糖胺聚糖（GAG）测量，采用二甲基亚甲基蓝（DMMB）方法，并记录每干重形成的软骨糖胺聚糖的总量。 GAG定量：通过木瓜蛋白酶消化和二甲基亚甲基蓝染色确定构建的细胞/聚合物的总GAG含量。用分光光度计在520nm的波长处测量消化的样品的光密度。免疫组织化学：福尔马林固定的组织切片。在37℃下用蛋白酶K处理60分钟，然后用缓冲盐水洗涤3次。在37°C用过氧化物酶封闭液处理10分钟，然后与抗体孵育。用两种抗体稀释I型和II型胶原1：150，并在37℃下作用于不同部位40分钟。用TBS冲洗后，切片并与HRP在37°C孵育40分钟。用TBS洗涤一次后，DAB会显色。 结果：细胞形态和结构的一般外观：细胞以单层培养，显示出小多边形，在1周后继续增殖并达到融合。移植后，所有裸鼠均存活，无临床发病率或死亡率。这种结构显示出稳定的植入物，没有组织反应的迹象。移植后四周和八周，处死3只裸鼠并取样。组织工程软骨为白色，光滑，有光泽且感觉坚硬，其抗压性与正常的透明软骨相似。

组织学结果：体外1、4和8周的体外组织学结果各不相同。体外成熟的腔隙细胞样品显示出低嗜碱性基质背景。体内样品在4周内被移植了分布较均匀的腔隙细胞，但组织的细胞核未成熟。移植了8周的样品显示，腔隙细胞均匀分布并包埋在嗜碱基质中。在第4和8周时，钽保持完整并与细胞和纤维蛋白嵌合。蓝绿色和特殊污渍在未成熟细胞中显示出蛋白聚糖稀疏透明的背景。移植后四周，细胞被弄圆，细胞外基质被染成蓝色，表明产生了蛋白聚糖。在8周的体内样品中，富含β的成熟细胞聚集并用细胞外基质广泛染色。 GAG定量：体外，体内4周和体内8周形成的每单位干重的GAG分别为47.32±3.12、58.37±1.28和72.40±2.72、使用方差分析的统计分析表明，从体外（1天）到体内（4周和8周），各组之间GAG的增加具有统计学意义。这表明延长的移植期导致体内环境中高质量软骨组织的形成。

免疫组织化学构造：移植后，组织工程化的软骨从不成熟的组织发展到4-8周成熟。在第8周，组织学特征显示腔隙化和细胞外基质增加。体外构建的软骨细胞分布较差，腔隙形成较低。在体内，构建了显示强烈表达II型胶原的棕色变色细胞。观察到I型胶原蛋白的免疫阳性反应较弱。

实时PCR检测：与体外构建4周和8周相比，软骨相关基因（II型胶原，聚集蛋白聚糖核心蛋白，SOX9转录因子）的表达显着。这表明体内组织工程化的软骨可以产生成熟的软骨表型。但是，在施工4到8周之间没有观察到显着差异。结论：钽支架蛋白作为细胞载体已被证明能促进兔关节软骨细胞的细胞增殖和软骨形成。组织工程和生化评估，GAG定量，免疫组织化学和实时PCR证明，体内移植的软骨显示出高质量的透明组织。这项研究的结果突出了钽软骨细胞纤维蛋白复合物治疗软骨缺损的潜力。