Cell:微生物代谢产生的丙酸咪唑通过mTORC1阻碍胰岛素信号传导

肥胖、糖尿病、心血管疾病等与代谢紊乱相关的疾病与肠道微生物的结构和功能密切相关。体内微生物会明显影响到进食后体内的代谢反应及代谢物。已有研究表明，短链脂肪酸、氧化三甲胺（Trimethylamine N-Oxide， TMAO）、支链氨基酸、谷氨酸和一些氨基酸衍生的尿毒症毒素等代谢物均受肠道微生物调控影响。作者注意到近期一项研究，芳香氨基酸可以在肠道菌作用下代谢为具有生物活性的物质。然而，对氨基酸衍生的代谢物是如何导致疾病的机制仍不清楚。（代谢组学）

实验设计

该研究首先进行了小样本数（5例二型糖尿病（type 2 diabetes， T2D）患者及与其体重指数匹配的10例健康受试者的门静脉血浆）的非靶向代谢组学分析（HPLC-MS/MS， GC-MS），发现丙酸咪唑（imidazole propionate， ImP）在T2D患者体内显着升高 [false discovery rate (FDR) < 0.1]。然后通过靶向代谢组学，对有菌小鼠（CONVR）与无菌小鼠的代谢进行对比，同时通过受试者粪便微生物体外培养和分析，证明了ImP与微生物代谢的相关性。结合宏基因组分析，鉴定了可以将尿刊酸代谢为ImP的菌群，进一步在动物和人体原代细胞中验证其信号传导通路，解释了ImP降低葡萄糖耐量及在胰岛素受体底物（insulin receptor substrate， IRS）水平抑制胰岛素信号传导的潜在作用途径。

实验结果

1.    丙酸咪唑与人类二型糖尿病相关

肠道中产生的细菌代谢物通过门静脉到达肝脏，然后进入体循环。为了鉴定可能导致胰岛素抵抗和T2D的氨基酸衍生的微生物代谢物，研究人员采用5例T2D患者 [body mass index (BMI) > 40] 及与其体重指数匹配的10例健康人的门静脉（Porta）血浆进行非靶向代谢组学研究（HPLC-MS/MS， GC-MS），发现四种氨基酸衍生的代谢物（硫酸多巴胺、谷氨酸、ImP和N-乙酰基腐胺）在T2D患者体内显着升高（FDR<0.1），其中产生ImP的代谢途径如图1所示。为了验证代谢物与微生物的相关性，在有菌小鼠（CONVR）和无菌小鼠（GF）门静脉与腔静脉（Cava）血浆中检测这四种代谢物，只有ImP表现出显着差异，谷氨酸差异不明显，而硫酸多巴胺和N-乙酰基腐胺未检测到（图2）。

此外，采用多反应监测（multiple reaction monitoring， MRM）扫描模式对上述5例T2D患者及10例健康受试者的血浆ImP进行了靶向定量分析，并采用二级质谱分析进行了结构确证（图3）。

为了进一步验证T2D患者外周静脉血中ImP含量升高，研究招募了另外649名受试者，根据葡萄糖耐量不同将其分为4个组（NGT， normal glucose tolerance； IFG， impaired fasting glucose； IGT， impaired glucose tolerance； T2D）。结果证明ImP水平在T2D患者体内显着升高，相比之下，ImP的前体尿刊酸在各组间无显着差异（图4）。

2.    丙酸咪唑是肠道菌代谢产物

为了直接证明ImP是微生物作用下产生的代谢物，研究者们以受试者粪便微生物群为样本建立了体外肠道模拟器来监测ImP的代谢变化。在用受试者的粪便微生物提取物稳定模拟器环境一周后，给予微生物群落10mM组氨酸并连续监测ImP水平7小时，测量终点显示，T2D患者的相关微生物群会产生更高浓度的ImP（图5）。

为了鉴定以尿刊酸为底物产生ImP的细菌，研究者们对将尿刊酸代谢成ImP的还原酶（UrdA）进行了基于活性位点中FAD结合域的大规模筛选，在细菌基因组中鉴定了812个UrdA同源物，结果表明只有FAD结构域中373位是酪氨酸（Y）和甲硫氨酸（M）而非组氨酸（H）的UrdA才具有催化此反应的活性（图6A）。基于这一结果，在T2D人类宏基因组数据中鉴定了42种菌株具有上述类型的UrdA，其中28种（67%）菌株在T2D患者中高表达（图6B， C）。

3.    丙酸咪唑降低糖耐量并削弱胰岛素信号传导

进一步利用GF小鼠、CONVR小鼠、原代肝细胞及人类胚胎肾细胞系HEK293等对ImP影响T2D的作用机制进行了一系列研究。证明了ImP在胰岛素受体底物（IRS）水平上对胰岛素信号传导具有负面影响。研究者们推测ImP是通过mTORC1抑制胰岛素信号传导，并进行了Raptor、S6K1基因敲除等验证实验，最终证明ImP可以在体内生理（病理）条件下充当mTORC1的激活剂。此外，还发现ImP诱导来自CONVR小鼠的肝脏和原代肝细胞中p62的磷酸化，且mTORC1位于p62磷酸化的下游。最后，与最初ImP在T2D患者体内含量高的实验结果一致，研究者们发现T2D患者肝脏中p62和S6K1的磷酸化水平高于健康受试者。以上研究表明，ImP通过在细胞水平激活p38g / p62 / mTORC1途径抑制IRS水平的胰岛素信号传导（图7）。

总结

该研究鉴定出ImP是一种组氨酸经肠道菌的代谢物，其在T2D患者的血液中含量显着增加，并还鉴定了可能产生ImP的肠道菌种类。进一步的机制研究结果显示，ImP通过在细胞水平激活p38γ / p62 / mTORC1途径来抑制IRS水平的胰岛素信号传导。在肝脏中验证这一发现，结果表明T2D患者肝脏中p62和mTORC1的激活增加，与ImP对人类胰岛素信号传导损伤的潜在作用一致。此外，由于ImP诱导mTORC1的持续活化，它可能与mTORC1过度活化引起的相关疾病有关，常见的有糖尿病并发症（视网膜病，肾病和心力衰竭），在癌症中也有类似机制。