一.   服务介绍                            

       以下是根据NIH老年病研究所提供的英文的R1胚胎干细胞培养protocol整理而成。根据经验作部分修改。

一般培养：

       保持胚胎干细胞处于未分化状态

体外分化

      培养基      包被有多聚鸟氨酸/纤维结合蛋白的培养板（使用或不使用盖玻片）

二.实验方法                            

体外分化方法

       维持ES细胞处于未分化状态

       ES细胞培养用含有LIF（白血病抑制因子）和Feed细胞的培养基（高糖）来阻止细胞的分化。为细胞提供包被有0.1％明胶的平板作为粘附细胞的基质。

       建议每2－3天从达到80％－90％融合的平板按1：8的比率传代细胞一次，细胞传代以后，在将细胞接种在0.1％明胶包被的培养皿之前，通过预先将细胞接种在没有经过包被的组织培养板2个小时，使分化细胞粘附，从而将分化和未分化细胞分开。

       将细胞全程置于37℃，5％CO2，100％湿度条件下培养。如果在Feed细胞，那么就需要采用MMC进行处理，抑制Feed细胞增殖，但仍然能保持其分泌LIF因子的活性。下文中暂不提及Feed细胞。Feed细胞可以来源于STO细胞或原代胚胎成纤维细胞。

      配制一20×不含DMEM，HS，LIF的溶液（该溶液也能用于EB培养基--见下文）。分装在50ml 离心管中，（稀释为2×，每管42ml），贮存在-20℃。

       通过将21ml该溶液，HS和LIF加入450ml DMEM中制备培养基，0.22 μm滤膜过滤。贮存于4℃，时间不要超过2周。贮存液       DMEM(高糖)       马血清（HS）       L-谷氨酰胺（200mM）       MEM NEAA（10mM）       HEPES（1M）       β-巯基乙醇（55Mm）       PEST       LIF

三.实验步骤                            

       1、从液氮中取出一管细胞；      

       2、将冻存管置于37℃水浴中2分钟（或放到管内溶液恰好完全溶解）；     

       3、将细胞转移到一15ml Falcon管中；    

       4、加入5ml ES培养基（用培养基冲洗冻存管）；      

       5、离心3分钟；      

       6、弃上清，用2ml ES培养基重悬细胞，至少吹打10次；      

       7、接种在明胶包被（见下文）的6孔或6cm组织培养皿；      

步骤：       

        1、1×PBS洗细胞并留少许PBS在培养皿内；      

        2、用细胞刮刀收集细胞；      

        3、将细胞转入15ml 离心管管内并离心3分钟；    

        4、弃去上清并将细胞重悬于冷的冻存液中（10 cm的培养皿用2ml，15cm的培养皿用6－7ml。）   

        5、分装于冻存管内，每管1ml；    

准备500ml 0.1％geltin溶液      

       1、将0.5 g明胶溶解在500ml无钙镁的PBS中（50－65℃水浴15～30分钟）。    

       1、加入足量的明胶溶液覆盖培养平面（15 cm培养皿加2ml，10 cm培养皿加0.5～1 ml，溶液的量并不重要，只要能完全覆盖培养表面就行了。）；      

       2、置室温30分钟；      

       建议每2天传代细胞一次，过度生长的细胞会降低细胞的自然分化率，我们建立了一种纯化方法来去除分化细胞，在将细胞接种在明胶包被的培养板上之前，通过将分化细胞黏附在没有包被的组织培养板上去除分化细胞。纯化步骤包含在下面的方法中。

       1、去除培养液；     

       2、无钙镁PBS（Gibco）洗涤；      

       3、加入胰酶EDTA（Gibco）。37℃孵育5分钟。      

       4、加入ES。培养基使胰酶失活；      

       5、将细胞转入15 ml离心管中离心3min；      

       6、去除上清，将细胞重悬于2 ml ES培养基，至少吹打10－20次。如果加入培养基的量较少会比较容易将细胞团弄散分开。ES细胞有聚集成团的倾向，传代过程中仔细将细胞弄散分开很重要。这样可能会减少细胞的自然分化。      

       7、将细胞接种在没有包被的组织培养皿中（使用和一开始同样规格的培养皿）放入温箱2小时（分化细胞在该时间内将黏附，而ES细胞仍将保持悬浮）； 

       8、将含有细胞的培养基转入geltin包被的组织培养皿。吹打以确保细胞被分散开（前面已经提到--ES细胞有聚集成团的倾向）      

       保持细胞的传代比率很重要，以我们的经验，1：8的比率是好的，可以使细胞的自然分化降到最低。当你使用不同规格的培养板进行细胞传代可以使用表1来计算传代比率。

       小鼠胚胎干细胞培养实验步骤

       (本文来源丁香通）