一.服务介绍                            

       基本原理在于：样本经亚硫氢酸盐处理后,甲基化的胞嘧啶（C）保持不变,但非甲基化的胞嘧啶被转化成脲嘧啶,因此在利用该处理产物作为模板的PCR产物中,甲基化的胞嘧啶还是胞嘧啶,但非甲基化胞嘧啶变成了脲嘧啶（胸腺嘧啶）,此时检测到的胞嘧啶（C）即是样品中本身的甲基化位点

二.实验方法以及步骤                    

第一部分 基因组DNA提取。

       这一步没有悬念，完全可以购买供细胞或组织使用的DNA提取试剂盒，如果实验室条件成熟，自己配试剂提取完全可以。DNA比较稳定，只要在操作中不要使用暴力，提出的基因组DNA应该是完整的。

       此步重点在于DNA的纯度，即减少或避免RNA、蛋白的污染很重要。因此在提取过程中需使用蛋白酶K及RNA酶以去除两者。

使用两者的细节：

       1：蛋白酶K可以使用灭菌双蒸水配制成20mg/ml；

       2：RNA酶必须要配制成不含DNA酶的RNA酶，即在购买市售RNA酶后进行再处理，配制成10mg/ml。否则可能的后果是不仅没有RNA，连DNA也被消化了。两者均于-20度保存。

验证提取DNA纯度的方法有二：

       1：紫外分光光度计计算OD比值；

       2：1%-1.5%的琼脂糖凝胶电泳。

       第二种方法，这种方法完全可以明确所提基因组DNA的纯度，并根据Marker的上样量估计其浓度，以用于下一步的修饰。

第二部分 亚硫酸氢钠修饰基因组DNA

       如不特别指出，所用双蒸水（DDW）均经高压蒸汽灭菌。

       1：将约2ugDNA于1.5mlEP管中使用DDW稀释至50ul；

       2：加5.5ul新鲜配制的3M NaOH；

       3： 42℃水浴30min；

水浴期间配制：

      4：10mM对苯二酚（氢醌），加30ul至上述水浴后混合液中；（溶液变成淡黄色）

      5： 3.6M亚硫酸氢钠（Sigma，S9000），配制方法：1.88g亚硫酸氢钠使用DDW稀释，并以3M NaOH滴定溶液至PH 5.0，最终体积为5ml。这么大浓度的亚硫酸氢钠很难溶，但加入NaOH后会慢慢溶解，需要有耐心。PH一定要准确为5.0。加520ul至上述水浴后溶液中。

       6：EP管外裹以铝箔纸，避光，轻柔颠倒混匀溶液。

       7：加200 ul 石蜡油，防止水分蒸发，限制氧化。

       8：50℃避光水浴16h。

这一步细节：

       1：基因组DNA的量不需十分精确，宁多勿少，因为在以后纯化回收步骤中会有丢失，且此方法修饰最多可至4ug。

       2：所有试剂均须新鲜配制，所以配液的技术要过关，既要快，又要精确。

       3：亚硫酸氢钠溶液呈强酸性，一定用碱将PH调制5.0，否则PH不合适会影响后续纯化吸收。

       4：水浴最好达16小时，虽可以短至8小时，但后者修饰会有不完全。

       （本文转载小木虫）