一.   服务介绍                                 

        凝胶迁移或电泳迁移率实验（EMSA）是一种研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用的技术，可用于定性和定量分析。通常将纯化的蛋白或细胞粗提液和标记的DNA探针一同保温，在非变性的聚丙烯凝胶电涌上，分离复合物和非结合的探针，DNA-复合物比非结合的探针移动慢。常用实验手段有同位素32P法和非同位素法（化学发光法）。

       标记探针根据研究结合蛋白的不同，可以是双链或是单链。当检测如转录调控因子一类的DNA结合蛋白，可以纯化蛋白，粗蛋白或核细胞抽提液。竞争实验中采用含蛋白结合序列的DNA片段和寡聚糖核苷酸片段（特异）和其他非相关的片段（非特异性）来确定DNA结合蛋白的特异性。在竞争的特异性和非特异性片段的存在下，依据复合物的特点和强度来确定特异性结合。

二.实验方法以及步骤                     

 1. 探针的标记

2. 非变性电泳

       （1）制备4%非变性胶

       （2）制备样品

       （3）电泳：预跑胶30-60min，100V，上样，跑胶，100V，30min左右

 3. 转膜：

       将胶取下，放在大小相似的尼龙膜上，上下各加1层润湿的blotting paper , 放到半干转移装置上，100V，380mA , 转膜1H.

 4. 紫外交联:

      取出膜，在紫外交联仪中交联，999.9mJ，固定10min。

5. 洗膜

       （1）将封闭液和4倍洗涤液置于37-50℃溶解。

       （2）用20ml封闭液封闭尼龙膜，温浴15min，摇船轻摇。

       （3）20ml封闭液中加入66.7ul Stabilized Streptavidin-Horseradish Peroxidase Conjugate(1:300稀释)，配制成conjugate/blocking solution。

      （4）将膜从封闭液中取出，在conjugate/blocking solution中轻摇15min。

      （5）将4倍洗涤液用双蒸水稀释成1倍洗涤液。

      （6）将膜置于新的培养皿，用20ml1倍洗涤液冲洗。

      （7）用1倍洗涤液洗膜4次，每次5min，摇床轻摇

。

      （8）在新培养皿中加入30ml Substrate Equilibration Buffer,将膜放入，温浴5min，摇床轻摇。

      （9）加入6mlLuminol/Enhancer Solution 和6ml Stable Peroxide Solution, 避光置于锡箔纸包好的烧杯中，摇匀，作为Substrate Working Solution。

      （10）将膜从Substrate Equilibration Buffer中取出，用滤纸尽量吸去液体，放入新的培养皿。

      （11）将Substrate Working Solution用枪慢慢加到膜上使液体尽量到达整张膜，静置5min。

      （12）取出膜，控制膜不能干燥。

      （13）用保鲜膜将膜包好，不能有气泡。

      （14）在暗室中，将膜放入曝光盒，用X-ray胶片压片，曝光。

       (本文转载丁香通）