生物实验外包       

       在制作石蜡组织切片标本的实践中，笔者体会到要做出质量好的组织切片标本，必须把握制作中的每个环节。为确保组织切片标本制作的顺利进行，现将操作要点介绍如下。

1. 取材

       动物处死后，应快速取出所需的组织。取材的刀要锋利，严禁用手或镊子挤压，以免损伤组织。切取的组织块厚度一般为0.5~1.0cm，大小1.5~2.0cm，以免影响固定效果。

2. 固定

       固定是将组织块用化学试剂浸泡，使组织内的蛋白质等成分迅速凝固或沉淀，停止细胞濒死前或死亡后的变化。同时组织固定后不易变形，有利于以后的组织处理。所以组织一旦离体必须及时固定，固定液的量大约为组织的5倍。常用10%的福尔马林、zenker氏等固定液。固定时间约为24h。

3. 冲洗

       固定好的组织块需经流水冲洗24h，冲洗不彻底容易造成脱片和染色不佳。对需做免疫组织化学的组织，更不能忽视这一步骤。

4. 脱水和透明

       脱水就是利用脱水剂将组织内的水分置换出来，以利于有机溶剂的渗入。脱水是否彻底，直接关系到组织能否充分透明。脱水一般采取上行梯度酒精，从80%酒精、95%酒精至无水酒精。还要注意组织在无水酒精内时间过久，容易发脆，一般约为4h。

       组织块脱水后就进入透明步骤，即经过一种既能与脱水剂混合，又能与石蜡相溶的媒介物质。目前最好的透明剂是二甲苯，但二甲苯容易使组织发脆，所以在二甲苯中时间也不宜过长，一般40~60min。

5. 浸蜡

        组织透明后，在熔化的石蜡内浸渍的过程称为浸蜡。浸蜡温度过高（超过70℃），会导致组织发硬，还会使组织内的抗原受到破坏。浸蜡用的石蜡熔点一般在56℃~60℃，浸蜡温度控制在60℃~70℃。

       浸蜡时间的长短直接影响组织切片，不同的组织浸蜡时间不同，通常较脆组织如肝、甲状腺、脾等浸蜡2~3h，含有结缔组织的器官如胃、膀胱、肠等浸蜡时间要延长6h。所用的石蜡如有杂质尽可能过滤，以防附着在组织上，影响切片与观察。

6. 包埋

       用包埋剂来支持组织的过程称为包埋。最常用的是石蜡包埋法。包埋的关键是平整和方位。包埋时，要求用镊子轻压组织块拱起部份，使之平贴于底部，通常采用组织的最大面包埋；囊壁、管腔组织应竖直包埋。修去两边的余蜡（指切片时与切片刀垂直的两侧）。

7. 切片

       切片的第一步需粗切。粗切的厚度20~40μm，粗切至组织全部暴露后，再进行细切。细切至组织块表面均匀一致，无白点。切片时要求用力均匀、柔和，切片厚度一般为3~5μm，切下的蜡膜大小、形状应与组织块上的组织大小形状一致。

       如气温较高，石蜡组织块较软可用冰块局部冰冻（操作状态下），使组织块变硬便于做连续性切片；如气温较低、石蜡组织块较硬时可用大拇指热敷或用嘴吹气加温，使组织块变软再做连续性切片。

8. 展片与捞片

       把切片放入温水中展开即为展片。展片水温应在48℃~55℃，这主要和包埋蜡的熔点有关：水温过高，会引起组织细胞散开；水温过低，切片皱摺无法摊平。展开片子上的皱摺，有两个方法：①在切片时边切边向蜡片吹气，这样片子放到热水里会自然展平；

       ②切片结束后，先把切片放在30%酒精水溶液中，让酒精的张力自动把皱摺展开，然后再将切片移到热水中，酒精浓度不宜过高，否则容易引起切片破碎，出现裂隙。脂肪类组织遇到酒精会散开，故不能用此法。捞片时，要选择那些完整、无皱摺的切片，粘贴于载玻片上。

9. 烤片和脱蜡

       烤片是烤干切片上多余的水分和石蜡，并使切片与载玻片牢固粘贴。一般在60℃的温箱内进行，温度过高，会引起切片的组织细胞收缩；时间太短（少于20min），容易造成脱片。

       脱蜡也相当重要，如果脱蜡不干净，切片不易着色或着色不匀。所以在脱蜡过程中，脱蜡剂（松节油）要常更换（用15~20次）。烤片结束后立即将切片放在温箱内预热（40℃~45℃）的松节油Ⅰ、Ⅱ中15min，然后经下行梯度酒精洗去松节油至水。

10. 染色

       按常规的HE染色。染色理想的切片在显微镜下应是细胞核与细胞质蓝红相映，色泽鲜艳，核浆对比明显，核膜及核染色质颗粒清晰可见。

11. 脱水和封片

       切片脱水采用上行梯度酒精。浓度低的酒精比浓度高的酒精更容易脱水，但也容易使伊红退色，故脱水时间要短（1~2min），也可无须用酒精脱水而直接晾干。切片经二甲苯透明。用中性树胶封片，一定要避免气泡的产生。

       （本文转载丁香通）