前阵子听说上海生科院 320 大院的马同学正在使用 CST 的 PD-L2 抗体（#82723）在多种人组织上进行免疫组化实验。然而，多次实验均无法得到结果，切片上的细胞「团灭」而归。CST 技术人员闻悉后，决定进行实地探访，与科研人员一起，找到问题所在。

前期准备

在经过前期与马同学的讨论后，决定在这次测试中，对原 protocol 进行如下重大调整：

1. 测试时增加阳性/阴性对照片（Control slides：SignalSlide^® PD-L1 IHC Controls #13747），确保抗体和染色结果的特异性；

2. 将高压修复法调整为微波修复法；

3. 使用 CST 的 EDTA 修复液；根据 CST 的 protocol，增加修复液的用量（适用组化修复缸，用量为200 mL/次），且修复后不冷却切片；

4. 使用全套 CST 辅助试剂，即 ImmunohistochemistryApplication Solutions Kit (Rabbit) #13079，确保体系的稳定性。 

实验步骤

脱蜡与水化

1. 二甲苯脱蜡：3 × 5 min。（为确保测试时二甲苯新鲜，使用新的二甲苯）

2. 乙醇水化：100% 乙醇2 × 10 min；95% 乙醇，2 × 10 min。

3. 洗涤：切片浸没于ddH2O中，3 ×5 min。

抗原修复

4. 修复：使用200 mL ddH2O稀释后的SignalStain^® EDTA Unmasking Solution#14747进行修复，根据实验室微波炉的实际情况，高火档加热2 min45sec后煮沸，立即换保温档，保温15 min。修复后切片不冷却，直接进行下一步。

5. 洗涤：切片浸没于dH2O中，3 ×5 min。

去除内源性过氧化物酶

6. 3% 过氧化氢处理切片，加盖室温放置15 min。（加盖的目的是为了防止过氧化氢与空气接触后并不稳定）

7. 洗涤：切片浸没于dH2O中，2 ×5 min。

8. 缓冲液转换：切片浸没于TBST中，1 ×5 min。

封闭与一抗孵育

9. 配置封闭液（Animal-Free Blocking Solution #15019），滴加在切片上，室温静置1 h。（此步建议一张张完成，防止干片）

10. 配置一抗：使用SignalStain^® Antibody Diluent #8112 稀释PD-L2抗体（#82723）稀释度为1：200。

11. 横沥封闭液，用卫生纸尽量吸干封闭液后，将一抗滴加在切片上。（此步建议一张张完成，防止干片）

12. 将湿盒小心移入4度冰箱，过夜。

二抗孵育与显色

13. 小心取出湿盒，在室温平衡45分钟左右。

14. 洗涤：切片浸没于TBST中，3 ×5 min。

15. 将二抗SignalStain^® Boost IHC Detection Reagent (HRP, Rabbit)#8114 滴加于切片上，室温孵育40 min。

16. 洗涤：切片浸没于TBST中，3 ×5 min。

17. 配置显色液：将一滴SignalStain^® DAB Chromogen Concentrate（约30ul）加入1 mL SignalStain^® DAB Diluent中，混匀。

18. 将显色液滴加于切片上，于显微镜（10倍目镜）下观察染色情况，待看到棕黄色阳性沉积，且背景不深时，将切片浸没于ddH2O中，终止染色。

19. 按实验室常规步骤复染核、封片。

测试结果

使用PD-L2的阳性对照切片SignalSlide^® PD-L1 IHC Controls #13747，在阳性细胞团中见到阳性染色，在阴性细胞团中未见染色，提示抗体适用于石蜡切片，且特异性佳。

编后记

科研实验向来不是「躺赢局」，必须是「尽力局」：Victory 固然好，Defeat 也不用气馁，分析战后数据，调整实验方案和策略，下一次「匹配」开始后又是一场全新的战斗。

（本文转载丁香园）