细胞冻存方法

一般来说，细胞进行转移，最佳的策略是进行低温保存（-70℃~-196℃），而细胞深低温保存的基本原理是：在-70℃以下时，细胞内的酶活性均已停止，即代谢处于完全停止状态，故而可以长期保存。细胞低温保存的关键，在于通过0~20℃阶段的处理过程，在此温度范围内，冰晶呈针状，极易招致细胞的严重损伤。

经过前人的长期试验，发现细胞的冻存及复苏基本原则是慢冻快融，这样科研最大限度的保存细胞活力。

一、材料准备

1、仪器：净化工作台、离心机、恒温水浴箱、冰箱（4℃、-20℃、-70℃）、倒置相差显微镜、培养箱、液氮冰箱。

2、玻璃器皿：吸管（弯头、直头）、培养瓶、玻璃瓶（250ml、100ml）、废液缸。

3、塑料器皿：吸头、枪头、胶塞、移液管（10ml）、15ml离心管、冻存管（1~2ml）。

4、其他物品：微量加样枪、红血球计数板、记号笔、医用橡皮膏、移液枪。

5.PBS,胎牛血清，DMSO，培养液，双抗，胰蛋白酶（0.25%）

二、细胞冻存

目前细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质能提高细胞膜对水的通透性，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由冰晶形成的细胞损伤。

1、10%的DMSO+90%胎牛血清。甘油一般用于菌种保存很少用于细胞冻存。

2、取对数生长期的细胞，用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来，悬浮生长的细胞则直接将细胞移至15ml离心管中。

3、离心1000 rpm,5 min.

4、去除胰蛋白酶及旧的培养液，加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的最终密度为5x10^6/ml~1x10^7/ml.

5、 在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者。

6、  冻存：标准的冻存程序为降温速率-1~-2℃/min；当温度达到-25℃以下时，可增至-5℃~-10℃/min；到-100℃时，则可迅速浸入液氮中。也可将装有细胞的冻存管放入-20℃冰箱2h，然后放入-70℃冰箱中过夜，取出冻存管，移入液氮容器内。

三、细胞复苏

1、从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化。

2、从37℃水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以上培养液，混匀。

3、离心，1000 rpm，5 min。

4、弃去上层清液，加入含10%小牛血清培养液重悬细胞，计数，调整细胞密度，接种培养瓶，37℃培养箱静置培养。

5、次日更换一次培养液，继续培养。

四、细胞计数与存活测试

1、原理：

(1)计算细胞数目可用血球计数盘或是Coultercounter粒子计数器自动计数。

(2)血球计数盘一般有二个chambers，每个chamber中细刻9个1mm2大正方形，其中4个角落之正方形再细刻16个小格，深度均为0.1mm。当chamber上方盖上盖玻片后，每个大正方形之体积为1mm2×0.1mm=1.0x10-4ml。使用时，计数每个大正方形内之细胞数目，乘以稀释倍数，再乘以104，即为每ml中之细胞数目。

(3)存活测试之步骤为dyeexclusion，利用染料会渗入死细胞中而呈色，而活细胞因细胞膜完整，染料无法渗入而不会呈色。一般使用蓝色之trypan blue染料，如果细胞不易吸收trypan blue，则用红色之Erythrosin bluish。计算细胞活率：活细胞数/(活细胞数+死细胞数)×100%。计数应在台盼兰染色后数分钟内完成，随时间延长，部分活细胞也开始摄取染料;因为台盼兰对蛋白质有很强的亲和力，用不含血清的稀释液，可以使染色计数更为准确。

2、材料：

0.4%w/v trypan blue(GibcoBRL15250-061);Erythosin bluish stain;取0.1gram Erythrosin bluish(SigmaE-9259)及0.05gram preservative methyl paraben(SigmaH-3647)溶于100mlCa++/Mg++freesaline;血球计数盘及盖玻片(Hemocytometerandcoverslip);计数器(counter);低倍倒立显微镜;粒子计数器(Coultercounter,CoulterElectronics)。白细胞稀释液(4%乙酸溶液)。

3、步骤：

(1)取50μl细胞悬浮液与50μl trypan blue(orErythrosinbluish)等体积混合均匀于1.5ml小离心管中。

(2)取少许混合液(约15μl)自血球计数盘chamber上方凹槽加入，盖上盖玻片，于100倍倒立显微镜下观察，活细胞不染色，死细胞则为蓝色(或红色-Erythrosin bluish)。

(3)计数四个大方格之细胞总数，再除4，乘以稀释倍数(至少乘以2，因与trypanblue等体积混合)，最后乘以104，即为每ml中细胞悬浮液之细胞数。若细胞位于线上，只计上线与右线之细胞(或计下线与左线之细胞)。

注：4大格细胞总数×稀释倍数×104/4=细胞数/ml;每一大格的体积=2.5px×2.5px×0.25px=10-4ml计数板计数时，最适浓度为5～10×105细胞/ml，此范围外计数误差偏大。高浓度细胞悬液，可取出部分作稀释或连续稀释后计数。

五、注意要点

1、冷冻越慢越好，复苏越快越好

2、与液氮接触的操作，注意戴保护眼镜和手套。细胞复苏时，水浴中摇动小瓶易爆炸。且DMSO为有毒致癌品，接触时带好手套。

3、冻存细胞数量要足够，一般最低要达到5x10^6/ml。浓度视情况而定。

4、做好标记：培养瓶上应该用马克笔做好标记，写上细胞名称、代数和冻存时间。

5、对刚复苏的细胞动作要轻柔，避免细胞破裂。

6、DMSO对大多数细胞不敏感，所以解冻之后不需要除去DMSO，解冻后频繁换液会慢慢除去DMSO。部分对DMSO敏感的细胞需要除去DMSO。

7、解冻后的细胞要用和以前一样的培养液和血清，突然换不一样的培养液和血清会造成细胞生长不良，甚至死亡。