冷冻保存方法

       下面以肿瘤细胞和杂交瘤细胞为例，介绍非玻璃化冻存细胞的详细过程。

       1.  仪器设备：普通冰箱、-300C低温冰箱和-700C～-800C超低温冰箱、液氮冻存罐、高速离心机、电子计算机程控降温仪等；

       1.  待冻存细胞悬液的制备

       (1)按常规方法消化处于对数生长期的细胞培养物，制备单细胞悬液，并计算细胞总数；

       (2)将细胞悬液以800～1000r/min离心5min，去上清夜；

       (3)向细胞沉淀物中加入冷冻保护液，轻轻吹打混匀，使细胞密度达1×106～1×107个/ml；

       (4)按每管1～1.5ml的量分装于冻存管内，拧紧管盖；

       (5)再冻存管上做好标记，包括细胞代号及冻存日期。

       (1)先将冻存管放入普通冰箱冷藏室（4～80C），约40min；

       (2)接着将冻存管置于普通冰箱冷冻室（-100C～-200C），约30～60min；

       (3)将冻存管转入低温冰箱（-300C），放置30min左右；

       (4)然后将冻存管转移到超低温冰箱（-700C～-800C），过夜；

       (5)最后将冻存管投入液氮保存。

       做好冻存记录。记录内容包括冻存日期、细胞代号、冻存管数、冻存过程中降温的情况、冻存位置以及操作人员。

       冻存结果

       如此冻存的细胞，其存活率可达90%以上。

       在使用DMSO前，不要对其进行高压灭菌，因其本身就有灭菌作用。高压灭菌反而会破坏其分子结构，以致降低冷冻保护效果。在常温下，DMSO对人体有毒，故在配制时最好带手套。

       以下以人单核细胞为例说明这种细胞冻存方法（Takhashi et al. 1986）。

       1.  冷冻保护液：为Hanks平衡盐溶液加入20.5%DMSO（w/v）、15.5%乙酰胺（w/v）、10%丙二醇（w/v）和10%聚乙二醇（Mr 8000）而成。用2 mol/L NaOH调节pH至7.4，现配现用。

       1.  用常规方法分离全血中单核细胞；

       如此冻存的细胞，其存活率可达90%以上。

       玻璃化冻存法对细胞活性的保存具有较好的效果，不需要复杂的仪器设备，具有液氮储存设备即可使用。目前，该方法已在胚胎冷冻方面得到广泛应用，但很少应用于一般细胞的冻存。这可能与需要配制较复杂的冻存液以及冷冻前和复苏后较烦琐的操作有关。

       一、非玻璃化冻存的复苏方法

       1.  仪器设备：恒温水浴箱、高速离心机；

       1.  调配370C～400C的温水，或将恒温水浴箱的温度调节至370C～400C；

       复苏后的细胞应该保持其冻存时的活力，活细胞数达90%以上。

       细胞冻存悬液一旦融解后，要尽快离心除去冷冻保护液，防止冷冻保护剂对细胞产生毒性。实验人员在复苏细胞过程中，同样应具有自我保护意识，避免被液氮冻伤。

       以下以人的单核细胞为例说明其过程（Takhashi et al. 1986）。

       1.  设备：高速离心机；

       1.  将冻存管从液氮中取出，立即投入冰浴中5min。复温速率约5600C/min。一次可以进行多个冻存管的复苏；

       复苏后的细胞应该保存其冻存时的活力，活细胞数达90%以上。

       复苏时，冷冻保护液的稀释及去除过程与冻存前冷冻保护液的滴加过程一样，不能在室温下而必须在40C冰浴中进行，避免在室温下冷冻保护剂对细胞产生毒性。稀释过程也要缓慢进行，保证有足够的时间让冷冻保护剂从细胞内渗出，以达到细胞内外的平衡，避免高渗透压的损伤。