（1）胰蛋白酶 (Trypsin)

       ●在去除不需要的组织后，使用无菌的解剖刀和剪子把剩余的组织切成3~4 mm小片，通过悬浮在无钙镁的平衡盐溶液中清洗组织碎片。让组织碎片沉淀，去除上清液。重复清洗2到3次。

       ●将盛有组织碎片的容器置于冰上，去除残留的上清液。加入0.25%溶解在无钙镁的平衡盐溶液中的胰蛋白酶（100 mg组织加入1ml 胰蛋白酶）。

       ●在4℃孵育6到18小时，使几乎没有胰蛋白酶活性的酶尽可能渗透进去。

       ●移弃组织碎片中的胰蛋白酶，在37℃孵育包含残留胰蛋白酶的组织碎片20到30分钟。

       ●在组织碎片加入热的完全培养基，用移液管轻轻地分散组织。如果使用无血清培养基，要加入大豆胰蛋白酶抑制剂。

       （2）胶原酶 (Collagenase)

       ●用无菌解剖刀和剪子把剩余组织切成3~4 mm小片，用Hanks'平衡液（HBSS）清洗组织碎片几次。

       ●加入胶原酶（50～200单位/ml，溶解在HBSS中）。

       ●在37℃孵育4到18小时。加入3mM CaCl2增加解离效率。

       ●通过无菌不锈钢丝网或尼龙网过滤细胞悬液，以分离分散细胞、组织碎片和较大的碎片。如果需要进一步的解聚，在碎片中加入新鲜的胶原酶。

       ●通过离心在HBSS中清洗悬液几次。

       （3）Dispase

       ●用无菌解剖刀和剪子把剩余组织切成3~4 mm小片，用不含钙镁的平衡盐溶液清洗组织碎片几次。

       ●加入Dispase（0.6～2.4单位/ml 溶解在无钙镁的平衡盐溶液）

       ●在37℃孵育20分钟到几个小时。

       ●通过无菌不锈钢丝网或尼龙网过滤细胞悬液，以分离分散细胞、组织碎片和较大的碎片。如果需要进一步的解聚，在碎片中加入新鲜的Dispase。

       ●通过离心在平衡盐溶液中清洗悬液几次。

       ●再次培养时检测细胞的活性。

       ●细胞的活率应该超过90%

       （1） 移弃使用过的细胞培养基。

       （2）使用不包含有钙镁的平衡盐溶液或EDTA(ethylene diamine tetraacetic acid，乙二胺四乙酸.)清洗细胞（看表确定正确的清洗溶液）。在培养瓶对着细胞的一面加入清洗溶液，通过转动培养瓶1到2分钟清洗细胞层，然后去除清洗液。

       （3） 以2～3 ml/25 cm2的量，加选择的分离液(见表)到培养瓶对着细胞的一面。确保分离液覆盖细胞层。在37℃孵育培养瓶，轻轻摇动培养瓶。通常，在5到15分钟内，细胞就会脱落。细胞分离需要的时间因细胞系不同而有所变化。仔细监测细胞分离过程，避免细胞受损伤。对难于从培养瓶基层分离的细胞系，可以轻轻敲打，以加速分离过程。

       （4）当细胞完全分离时，垂直放置培养瓶，让细胞流到培养瓶的底部。在培养瓶中加入完全培养基，通过移液管在单层细胞表面反复吹打来分散细胞。计数并再次培养细胞。

       （5）对于无血清培养基，加入大豆胰蛋白酶抑制剂。通常使用1∶1（v∶v）0.25 mg/ml胰蛋白酶抑制剂到胰蛋白酶中将抑制胰蛋白酶活性。

        细胞分离技术

       （本文来源丁香通）