实验材料

       新生儿脐带

       试剂、试剂盒：PBS、胶原酶、M199培养基、胰酶、EDTA、DMEM培养基

       仪器、耗材：针头、手术钳、离心管、低温离心机、弯管、明胶、恒温培养箱、显微镜

实验步骤

       1. 将 15-20cm 长的新生儿脐带放入无菌的 PBS 溶液中储存。（注：4℃下最多贮存 24 小时，室温下不超过 6 小时，否则废弃）

       2. 用一个钝头的针头扎入脐带静脉管中，用无菌的 PBS 溶液冲洗 3-5 次，将污血冲洗干净为止。

       3. 用手术钳夹紧脐带下端，加入 15ml 的胶原酶（1mg/ml）室温下消化 15-20分钟，并不时上下摇动脐带。

       4. 消化完后，将下端手术钳松开，消化液流入一个 50 ml 无菌离心管中，用无菌的 PBS 溶液冲洗脐带 2-3 次。

       5. 将收集液离心（2000 转/ 分）3 分钟。

       6. 倒去上清，加入 10ml M199 培养基（加入 10U/ml 的 bFGF） ，用弯管吹散细 胞，将所有液体转入一个用明胶包被好的培养瓶中，37℃培养。（注：每个培养瓶中加入 3- 4ml 无菌的 1%的明胶溶液，摇匀使得明胶溶液完全 铺满瓶底，放入 37℃孵育，最少 2 小时，用前将明胶溶液倒了即可，明胶包被 有利于细胞贴壁。 ）

       7. 培养 24 小时后，倒掉培养基，并用无菌的 PBS 溶液清洗 2-3 次，洗掉红细 胞和死细胞，加入 10 ml 新鲜的 M199 培养基。

       8. 以后每 2 天换一次培养基（每次换掉 2/3 的培养基） 。

       9. 一般培养 5-7 天，细胞可长满至 80-90%单层，这时可以传代。

       10. 倒掉培养基，用无菌的PBS 溶液清洗 2-3 次，加入2- 3ml 消化液（0.25%胰酶+0.1%EDTA）消化细胞，在显微镜下观察，一旦细胞变圆，即加入 2-3 倍的有血清的 DMEM 培养基终止反应。

       11. 用弯管将细胞吹打下来，并将所消化的细胞转移到一个 50 ml 无菌离心管中，2000 转/ 分，离心 3 分钟。

       12. 倒掉上清，加入 10ml新鲜培基，一般一瓶细胞可传代 3-4 瓶，以后照此传代培养。

       13. 一般传代 2-3 代（培养了 20 天左右）用于做各种实验效果最好。

       （本文来源小木虫）