慢病毒包装实验-上海中洪博元

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细胞实验技术

慢病毒包装实验

实验材料

病毒

试剂、试剂盒

无血清培养基、脂质体、胰酶、含血清的培养基、DMEM

仪器、耗材

EP管、6孔板、CO2培养箱、高速离心机、-80°C冰箱

实验步骤

以六孔板中的1孔为例，每个样品需要1×106个293T细胞。

1. 取1.5ml灭菌EP管，加入1.5μg包装混合质粒和0.5μg表达质粒以及250μl的无血清培养基。轻柔混匀，室温孵育5min。

2. 取1.5ml灭菌EP管，取9μl 脂质体2000l溶于250μl无血清培养基中。轻柔混匀，室温孵育5min。

3. 将DNA溶液和脂质体溶液轻柔混匀。室温孵育20min

4. 用胰酶消化并记数293T细胞。用含血清的培养基重悬细胞。

5. 在六孔板中每孔，加入1ml含血清的生长培养基，再加入DNA-脂质体复合物。

6. 将1ml重悬的293T细胞（1×106个细胞/ml）加入到平板中。37℃CO2孵箱中孵育过夜。

7. 移除含有DNA-脂质体复合物的培养基移除，代之以DMEM（含丙酮酸钠和非必须氨基酸）。

8. 转染后48-72h收获含病毒的上清。3000 rpm 离心20min，去除沉淀。

9. 病毒上清-80°C贮存。

包装出来的慢病毒对NIH/3T3细胞达90%以上感染效率。

（本文来源丁香园）

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