(一) 有哪几类污染？

1、细菌污染

2、真菌污染

        真菌污染是细胞培养过程中最常见的一种，最常见的真菌有烟曲霉、黑曲菌、孔子霉、毛霉菌、白色念珠菌和酵母菌。培养细胞受真菌污染后，可见培养液中漂浮着白色或浅黄色的小点，有的散在生长，培养液一般不发生混浊；倒置显微镜下可见丝状、管状或树枝状的菌丝纵横交错在细胞之间或培养基中，有的呈链状排列。  

3、支原体污染

        支原体是介于细菌与病毒之间能独立生活的最小微生物，最小直径0.2μm，一般过滤除菌无法去除它，光镜下难以看清它的形态结构。开始不易发现，能在偏碱条件下生存，对青霉素有抗药性。多吸附于细胞表面或散在于细胞之间。  

4、病毒污染

5、非同种细胞污染

（二）污染类型的区别

1、细菌、真菌污染的检测

       (1) 肉眼观察----细菌、真菌污染常在传代、换液、加样等开放性操作之后发生，而且增生迅速，若有污染，在48小时内可明显观察到，例如培养液变混浊，或略加振荡有很多漂浮物漂起。  

       (2) 接种观察----用普通肉汤接种或用未加双抗药物的培养液接种，也可发现是否有污染。   

       (3) 镜下观察----倒置显微镜的高倍镜下可见培养液中有大量圆球状颗粒漂浮，即为细菌污染。细胞之间有丝状、管状、树枝状或卵形的物质常为真菌污染。   

2、支原体污染的检测

       (1) 相差显微镜观察----接取少许培养液滴在载物片上，再盖上盖片观察，支原体在镜下呈暗色微小颗粒，多位于细胞与细胞之间，有时可见类似于布朗运动的表现。

       注意与细胞破碎溢出的内容物如线粒体等相区别。  

       (2) 荧光染色法观察----荧光染料Hoechst33258，此染料能与DNA特异地结合，可使支原体内的DNA着色，荧光显微镜下支原体呈绿色小点，散在于细胞周围或附于细胞表面。 

       (3) 电镜检测----条件许可，可用扫描电镜或透射电镜观察。一般在细胞培养48～72小时，细胞接近汇合前，用胰酶消化细胞制成细胞悬液后进行固定、包埋、切片后才能进行观察。  

3、病毒的检测

       (1) 应用电镜技术快速诊断动物病毒病  

（三）污染清除方法

        培养细胞一经污染，多数较难处理。如果污染细胞价值不大，宜弃之；在寻找原因后彻底消毒操作室，复苏或重新购置细胞，再培养。  

1、细菌和真菌的清除

        抗生素对杀灭细菌较有效。联合用药比单独用药效果好。预防用药比污染后再用药效果好。 

2、支原体的清除

       (1) 用MRA处理 -----用MRA（Mycoplasma Removal Agent）处理细胞，每4天换一次液,连续处理15天以确保细胞纯洁健康，效果好。   

       (2) 用清洗纯化法清除支原体污染的方法 ----细胞营养驯化→优质细胞群的筛选→细胞清洗→反复离心洗涤。

       其原理是利用离心力、细胞、微生物质量和悬液的浮力差达到清除支原体的目的。由于支原体个体小且除发酵支原体外多为细胞外寄生,所以通过反复洗涤细胞和低速离心换液使其中潜在的支原体   数量降低至极限.如结合敏感抗生素的抑杀作用，可达到更好的效果。

       (3) 药物辅助加温处理 ----- 先用药物处理后，再将污染的组织培养物放在41℃培养18小时，可杀死支原体，但对细胞有不良影响。

       (4) 使用支原体特异性血清 ---- 用5%的兔支原体免疫血清可去除支原体污染，因特异抗体可抑制支原体生长，故经抗血清处理后11天即转为阴性，并且5个月后仍为阴性。但此法比较麻烦，不如用抗生素方便、经济。   

（四）污染的预防

        预防是防止细胞培养过程中发生污染的最好办法。只有预防工作做在前，才能将发生污染的可能性降到最小程度。一般预防可从以下几方面着手：

1、添加抗生素

2、从物品、用品消毒灭菌着手

       细胞培养所用物品清洗、消毒要彻底，各种溶液灭菌除菌要仔细，并在无菌试验阴性后才能使用。操作室及剩余的无菌器材要定期清洁消毒灭菌。   

3、从操作者做起 

       (1) 进无菌室前要用肥皂洗手，按规定穿隔离衣。工作开始要先用75%酒精棉球擦手、擦瓶口和烧灼瓶口。

       (2) 操作者动作要轻，必须在火焰周围无菌区内打开瓶口，并将瓶口转动烧灼。操作时尽量不要谈话，若打喷嚏或咳嗽应转向背面。

4、防止细胞交叉污染 

       (1) 在进行多种细胞培养操作时，所用器具要严格区分。

       (2) 在进行换液或传代操作时，注射器和滴管不要触及细胞培养瓶瓶口，以免把细胞带到培养液中污染其他细胞。   

5、无菌室的彻底消毒 

       (1) 0.1%新洁尔灭全面彻底擦洗无菌室；

       (2) 甲醛熏蒸法：甲醛是一种广谱灭菌剂菌，其水溶液和气休对各种细菌、芽孢及真菌等微生物均有杀灭作用。

       (3) 细胞培养，首先要避免污染，但在细胞培养过程中，有了污染用适当的方法清除，这样也可以保证细胞培养的成功。 

       （本文来源丁香通）