实验方法原理

       携带有目标蛋白基因的质粒在大肠杆菌BL21中，在 37℃，IPTG诱导下，超量表达携带有6个连续组氨酸残基的重组氯霉素酰基转移酶蛋白，该蛋白可用一种通过共价偶连的次氨基三乙酸（NTA）使镍离子（Ni2+）固相化的层析介质加以提纯，实为金属熬合亲和层析（MCAC）。蛋白质的纯化程度可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析

实验材料

       大肠杆菌BL21  

       试剂、试剂盒：LB液体培养基、 氨苄青霉素、 Washing Buffer Elution Buffer IPTG 、蒸馏水 、胰蛋白胨 、酵母粉、 氯化钠  

       仪器、耗材：摇床 、离心机、 层析柱、 离心管、 移液枪、 枪头盒 

实验步骤 

 一、试剂准备  

       1.  LB液体培养基：Trytone 10 g， yeast extract 5 g，NaCl 10 g，用蒸馏水配至1000 mL。

       2.  氨苄青霉素：100 mg/mL。

       3.  上样缓冲液：100 mM NaH2PO4，10 mM Tris，8M Urea，10 mM  2-ME，pH8.0。

       4.  Washing Buffer：100 mM NaH2PO4，10 mM Tris，8 M Urea，pH6.3。

       5.   Elution Buffer：100 mM NaH2PO4，10 mMTris，8M Urea， 500 mM Imidazole， pH8.0。

       6.   IPTG：100mM IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：2.38g IPTG溶于100ml ddH2O中,0.22μm滤膜抽滤，-20℃保存。

二、获得目的基因

       1.  通过PCR方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR循环获得所需基因片段。

       2.  通过RT-PCR方法：用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA，以mRNA为模板，逆转录形成cDNA第一链，以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。

三、构建重组表达载体

       1.  载体酶切：将表达质粒用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。

       2.  PCR产物双酶切后回收，在T4DNA连接酶作用下连接入载体。

四、获得含重组表达质粒的表达菌种

       1.  将连接产物转化大肠杆菌DH5α，根据重组载体的标志（抗Amp或蓝白斑）作筛选，挑取单斑，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步鉴定。

       2.  测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确,进入下步操作。否则应筛选更多克隆，重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点。 

       3.  以此重组质粒DNA转化表达宿主菌的感受态细胞。

五、氯霉素酰基转移酶重组蛋白的诱导  

       1.   接种含有重组氯霉素酰基转移酶蛋白的大肠杆菌BL21菌株于5 mL LB液体培养基中（含100 ug/mL 氨苄青霉素），37℃震荡培养过夜。

       2.  按1∶50或1：100的比例稀释过夜菌，一般转接1 mL过夜培养物于100 mL（含100 ug/mL 氨苄青霉素）LB液体培养基中，37℃震荡培养至OD600 = 0.6 - 0.8（最好0.6，大约需3 h）。取10 ul 样品用于SDS-PAGE 分析。

       3.   对照组不加诱导剂，实验组加入IPTG至终浓度0.5 mmol/l，37℃继续培养1-3h。

       4.  12 000 rpm 离心10 min，弃上清，菌体沉淀保存于-20℃或-70℃冰箱中。

六、氯霉素酰基转移酶重组蛋白分离、纯化

       1.  NTA层析柱的准备：在层析柱中加入1 mL NTA介质，并分别用8 mL 去离子水，8 mL上样缓冲液洗涤。

       2.  重组蛋白的变性裂解：在冰浴中冻融菌体沉淀，加入5 mL上样缓冲液， 用吸管抽吸重悬，超声波破裂菌体，用振荡器等轻柔的混匀样品60 min，4℃ 12000 rpm 离心 30 min，将上清吸至一个干净的容器中，并弃沉淀。取10 ul 上清样品用于SDS-PAGE 分析。

       3.  上清样品以10-15 mL/h 流速上Ni2+-NTA柱，收集流出液，取10 ul样品用于SDS-PAGE 分析。

       4.  洗脱杂蛋白：用Washing Buffer以10-15 mL/h流速洗柱，直至OD280 = 0.01分步收集洗脱液，约3-4 h，取10 ul洗脱开始时的样品用于SDS-PAGE 分析。

       5.  洗脱目标蛋白：用Elution Buffer洗柱，收集每1 mL 级分，分别取10 ul样品用于SDS-PAGE 分析。

注意事项

       1.  选择表达载体时，要根据所表达蛋白的最终应用考虑。如为方便纯化，可选择融合表达；如为获得天然蛋白，可选择非融合表达。

       2.  融合表达时在选择外源DNA同载体分子连接反应时，对转录和转译过程中密码结构的阅读不能发生干扰。

       3.  菌液OD值要小于1，否则细胞太浓太老，不易破碎，且质粒易丢失。

       4.  诱导时间最好做一个梯度，不同蛋白诱导时间需摸索。

       5.  诱导温度适当摸索：25、30℃。

       6.  IPTG浓度：一般在1 mM 以内，可适当摸索。 

       7.  超声条件可视实际情况改变，只要使菌体裂解充分即可，即菌液清亮不粘稠。

        蛋白质的表达、分离、纯化实验

       （本文来源丁香园）