PCR检测

       ⒈ 核酸片段的大小: 用于SSCP分析的核酸片段越小，检测的敏感性越高。对于<200bp的片段，SSCP可发现其中70％的变异；对于300bP左右的片段则只能发现其中50％的变异；而＞500bp的片段，则仅能检出10％～3O％的变异，因此，<300bP，尤其是150bP左右的核酸片段更适于SSCP分析。对于大于400bp的PCR产物就需要设法进一步处理，可以用限制性酶消化PCR产物，产生小于400bP的DNA片段，再进行SSCP分析。

       ⒉ 游离引物: 游离引物可能同 PCR产物结合而改变其泳动率，即使游离引物量为6nM都有明显影响。因此，应尽可能除去游离引物。可以采用不对称引物扩增方法，尽可能消耗多余的引物。也可以运用过柱或磁性球方法纯化PCR产物。或者是稀释PCR产物，减少游离引物的干扰。

       ⒊ 低浓度变性剂: 凝胶中加入低浓度的变性剂，如5％-10％甘油、5％尿素或甲酸胺、10％二甲亚砜（DMSO）或蔗糖等有助于提高敏感性，可能是因为轻微改变单链DNA的构象，增加分子的表面积，降低单链DNA的泳动率。但有些变异序列却只能在没有甘油的凝胶中被检出。因此，对同一序列使用2～3种条件做SSCP，可能提高敏感性。

       ⒋ 电泳温度: 一般认为保持凝胶内温度恒定是SSCP分析最关键的因素，温度有可能直接影响DNA分子内部稳定力的形成及其所决定的单链构象，从而影响突变的检出。室温下电泳适于大多数情况，但由于在电泳时温度会升高，为确保电泳温度相对恒定，应采取以下措施：减少凝胶厚度，降低电压，有效的空气冷却或循环水冷却等。

       ⒌ 凝胶的长度: 可用测序板进行SSCP分析，凝胶板长度在40cm以上。

       ⒍ 凝胶浓度及厚度: 凝胶浓度很重要，一般使用5％～8％的凝胶，凝胶浓度不同，突变带的相对位置也不相同，如果在进行未知突变种类的SSCP分析时，最好采用两种以上凝胶浓度，这样可以提高突变种类的检出率。凝胶的厚度对SSCP分析也很重要，凝胶越厚，背景越深，在上样量较多的前提下，尽量使凝胶越薄越好。

       ⒎ 假阴性: 一般认为，如没有污染，PCR－SSCP分析不存在假阳性结果，但可能出现假阴性结果，后者是由于点突变引起的空间构象变化甚微，迁移率相差无几所致，尤其是点突变发生在扩增片段的两端时。如果有阳性和阴性对照，结果可以重复确定的突变带是可信的，如果没有阳性对照，应经测序来确定其是否为突变带。由于PCR－SSCP的不足之处主要是可能检出假阴性结果。应通过设置阳性对照，摸索电泳条件，假阴性结果在很大程度上是可以避免的。但对未知基因变异的检测，假阴性结果就难以百分之百地消除。

       8. 结果分析: 单链凝胶电泳时，互补单链迁移率不同，一般形成两条单链带。PCR产物进行单链凝胶电泳之前，通过加热变性产生单链。如变性不彻底，残留双链亦可形成一条带．因此，PCR－SSCP分析结果至少显示三条带。但是，由于一种DNA单链有时可形成两种或多种构象，检出三条或四条单链带就不足为奇。  

       （本文转载丁香通）