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分子生物学技术miRNA

蛋白的生物活性测定方法
结晶紫法活性测定
蛋白检测
       1、取对数生长期的人胰腺癌SW1990细胞,用0.25%胰酶(以无钙镁离子PBS溶液配制,pH7.4)消化后,加入RPMI-1640培养基(10%新生牛血清,100U/ml青霉素,100U/ml链霉素,pH7.2)吹打细胞,使形成细胞悬液。进行细胞计数,使细胞数为2~2.5×105个/ml。接种于96孔细胞培养板,100µl/孔。接种细胞时须不断摇动细胞悬液,以保证各孔细胞数的均匀一致。96孔板放置于37℃、5%CO2培养箱中培养22h,观察到孔中细胞长满70~80%。

       2、在上述RPMI-1640完全培养基中加入放线菌素D,使终浓度为1.5µg/ml,配成样品稀释液。取此稀释液900µl至Eppendorf管中,另在9个5ml管中加入700µl稀释液。

       3、用完全培养基将基因工程人肿瘤凋亡素样品(上海恰尔生物技术有限公司研制,批号:0304,冻干粉剂,蛋白浓度:2mg/支)复溶至1000µl(液体样品测定蛋白浓度后,直接进行下一步操作),取出100µl至已装有900µl稀释液的Eppendorf管中,充分混匀,尽量不起泡沫。再从此管中吸出100µl至下一管中,如此反复n次(即测定前10倍稀释若干次,直到与估计活性相接近时)。

       4、从最后稀释的Eppendorf管中吸出700µl样品至已装有700µl稀释液的5ml管中,充分混匀。再从此管中吸出700µl至下一管同样装有700µl稀释液的5ml管中,如此反复9次(即测定时倍比稀释样品)。

       5、弃去96孔板中旧的培养基,从第一个5ml管中吸取已稀释的样品100µl至第2排细胞孔中,每个稀释度作6复孔(n=6);从第二个5ml管中吸取的样品加入第3排细胞中,依此类推,直至第10排孔结束。第1排中不含细胞,加入100µl/孔含有放线菌素D的稀释液作空白对照;第11排加100µl/孔稀释液作细胞对照;第12排加不含放线菌素D的RPMI-1640完全培养基。

       6、将加好样品的96孔板置37℃、5%的CO2培养箱中继续培养22h,显微镜下观察细胞形态变化,初步判断结果。

       7、弃除培养板中的培养基,每孔加入100µl染色液(1.5mmol/L结晶紫)染色30min。洗去染色液,甩去水分并在吸水纸上拍打以使干燥。冲洗程度以在吸水纸上拍打时,没有颜色出现为宜。

       8、充分干燥后,每孔加入100µl33%浓度的冰醋酸,在振荡仪上充分振荡使结晶溶解。设定λ=595nm酶联检测仪测定各孔的吸光值,据此数据进行统计学处理,计算出对细胞50%杀伤时所需的基因工程人肿瘤凋亡素的浓度。

[活性计算]

       活性单位定义:在上述测定条件下,以50%SW1990肿瘤细胞被杀伤时,为基因工程人肿瘤凋亡素的1个活性单位。

       1、样品的稀释度取常用对数。

       2、根据对应的细胞毒活性(光密度值)与稀释度的对数,进行线性回归,得到计算公式y=ax+b,分析相关系数R值,符合统计学要求者进行下一步分析。

       3、代入50%杀伤时的光密度值(即第11排细胞光密度值的一半),计算出稀释倍数的对数,再求出稀释倍数。

       4、根据原样品浓度及稀释倍数计算出基因工程人肿瘤凋亡素对细胞50%杀伤时的浓度,再算出比活性。

       5、其他细胞的检测方法同上,计算时根据对SW1990标定的基因工程人肿瘤凋亡素活性单位,先求出对细胞50%杀伤时的所需活性单位,再根据基因工程人肿瘤凋亡素对SW1990细胞杀伤的比活性算出相应的绝对量。

[计算结果]

       0304批原液:比活为:1.03×107活性单位/mg
微生物检测
蛋白的生物活性及结构测定方法

       生物活性测定[37,38]是将人胰腺癌1990细胞以2×105个/ml种入96孔细胞培养板,37℃5%CO2培养箱培养4-6小时,用完全培养液(加有1.2µg/m的放线菌素D)做梯度稀释的样品加入细胞板(n=3)。置37℃5%CO2培养箱,18h后弃上清,以结晶紫固定液(结晶紫0.5%,甲醛8%,NaCl0.1%,乙醇20%)染色15min,蒸馏水洗去结晶紫。每孔再加入200μ33%的乙酸,旋涡混匀,置酶联仪读出D(595)值,以未加细胞的空白孔为D本底。根据活性单位定义:使培养孔中的细胞50%死亡为一个单位。


 MTT法――活性测定


       1、接种细胞:用0.25%胰蛋白酶消化单层培养细胞,用含10%胎牛血清的RPMI1640培养液配成单个细胞悬液,以每孔103-104个细胞接种于96孔板中,每孔体积200μl。

       2、培养细胞:将培养板移入CO2培养箱中,在37℃、5%CO2及饱和湿度条件下,培养3-5天。(培养时间取决于实验目的和要求)

       3、呈色:培养第3-5天后,每孔加入MTT溶液(5mg/ml)20μl,37℃,继续孵育4h,终止培养,小心吸弃孔内培养液上清。每孔加入150μlDMSO(二甲基亚砜),振荡10min,使结晶物充分溶解。

       4、比色:选择490nm波长,在酶标仪上测定个孔吸收值,记录结果。

MTT检测

       (本文转载丁香通)

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