一、荧光原位杂交（FISH）

       是一种简单、敏感、而容易操作的方法，结果迅速，并能在同一标本上检测多个不同的基因，可应用于细胞培养、染色体分裂像、冰冻切片和石蜡切片。

FISH实验步骤

试剂配制：

       （1）变性液（70%甲酰胺 + 2×SSC，pH7.0）：4 ml 20×SSC；8 ml 蒸馏水；28 ml 甲酰胺。每次新鲜配制。

       2.  蛋白酶处理：

       （1）每个染色缸40 ml 蛋白酶K消化溶液，配制方法如下：2×SSC 40 ml 倒入Facal管，在水浴槽中预热。将消化酶液加入管内，摇动直到酶溶解。

       （2） 37℃水浴槽中预热染色缸和蛋白酶K溶液。37℃孵育20 min。

       （3） 2×SSC在室温下漂洗切片3次，每次1 min。

       3.  变性：

       （1）每一个立式染色缸配制40 ml 变性溶液；

       （2）78℃水浴槽中平衡预热混合液染色缸；

       （3）78℃孵育8 min；

       （4） 即移入-20℃预冷70%酒精的染色缸内2 min，再依次移入80%、90%和100%的-20℃预冷酒精内，每缸2 min；

       4.  杂交：

       （1）准备探针；

       （2）取一个较大的湿盒，交叉放置切片；

       （3）滴10 μl 探针在切片的组织上，加盖玻片；

杂交后水洗：

       （5）镊子小心去除盖玻片；

       （6）43℃预热杂交后水洗溶液40 ml 水洗切片15 min；

       （7）2×SSC（37℃）洗两次，每次10 min；

检测：

       （9）从1×PBS中取出切片，除去过多的水分，避免标本干燥。把切片放入湿盒内，同时处理4张切片。

       （10）每张切片使用30~60 μl 罗丹明抗-地高辛抗体或FITC卵白素，室温下孵育20 min；

扩增：

       （12）从1×PBS中取出切片，斜置切片使液体排出；

       （13）每张切片滴30~60 μl 抗-卵白素抗体，加塑料盖膜，室温孵育20 min；

       （14）去掉塑料盖膜，把切片放入含1×PBS的染色缸。1×PBS室温下洗3次，每次2 min；

       （15）从1×PBS中取出切片，斜置切片使液体排出；

       （16）每张切片滴30~60 μl 抗-卵白素抗体，加塑料盖膜，室温孵育20 min；

       5.  细胞核染色：

       （1）张切片加10~20 μl DAPI，覆盖盖玻片并在室温下孵育2~5 ml；

二、用引物介导的原位标记（PRINS）

       是PCR和荧光原位杂交（FISH）的结合， PRINS是由未标记的序列特异性寡核苷酸探针与固定在细胞内的靶DNA互补序列，在聚合酶的驱动下，带有标记的脱氧核苷酸（FITC-dUTP或半抗原-dUTP）和dATP、dCTP、dGTP的延伸，依赖标记，新合成的DNA就能直接的或间接的带有FITC，用荧光显微镜观察。

PRINS实验步骤

       1.  常规脱蜡浸入0.01 mol/L PBS；

       2.  用0.2 mol/L 盐酸处理5min；

       3.  蛋白酶K（25 μg/ml）消化37℃ 15 min；

       4.  分别用80%，95%和100%酒精脱水，室温干片；

       5.  加PCR混合液25 μL（10 mmol/L Tris-HCl，50 mmol/L KCl，1.5 mmol/L MgCl₂，各加200 μmol/L dATP，dCTP，dGTP，1.5 mmol/L dig-11-dUTP 1.5 μl，引物250 ng，Taq DNA聚合酶2 U），加盖片；

       6.  94℃变性5 min后置入65℃湿盒中5 min；

       7.  用0.1×SSC液，65℃洗5 min；

       8.  片于65℃ 10~20 s；用4×SSC-0.1%吐温20液42℃洗5 min，2次；

       9.  经Buffer 1液洗后滴加20%羊血清封闭30 min；

       10.  加地高辛抗体复合物（1：500）室温下2 h；

       11.  BufferⅢ液洗5 min；

       12.  用BCIP-NBT显色1~2 h，在镜下控制，终止显色；

       13.  用中性红或核固红衬染，酒精脱水，二甲苯透明，树脂封片。

FISH

      （本文转载丁香通）