荧光定量pcr实验步骤

1、总RNA抽提（枪头和离心管均经过湿热灭菌，无RNA酶）

       1）取匀浆器，加入1ml的Trizol Reagent，置冰上预冷。

       2）取100mg组织，加入到匀浆器中。

       3）充分研磨直至无可见组织块。

       4）13000g离心10min取上清。

       5）加入250 μl三氯甲烷，颠倒离心管15s，充分混匀，静置3min。

       6）4℃下13000g离心8min。

       7）将上清转移到一新的离心管中，加入0.8倍体积的异丙醇，颠倒混匀。

       8）-20℃放置15min。

       9）4℃下13000g离心10min，管底的白色沉淀即为RNA。

       10）吸除液体，加入75%乙醇1.5ml洗涤沉淀。

       11）4℃下13000g离心5min。

       12）将液体吸除干净，将离心管置于超净台上吹3min。

       13）加入20μl无RNA酶的水溶解RNA。

2、反转录（枪头和PCR均经过湿热灭菌，无RNA酶）

       1）取一PCR管，加入含2μg RNA的溶液。

       2）加入1μl oligo(dT)15。

       3）用无核糖核酸酶的去离子水补足至12μl。

       4）于PCR仪上70℃保温5min，迅速置冰上冷却。

       5）依次加入4μl  5×buffer，2μl  10mM dNTPs，1μl RNA inhibitor和1μl 反转录酶，用枪抽吸混匀。

3、定量PCR

       1）取0.2ml PCR管，配制如下反应体系，每个反转录产物配制3管。

       2× qPCR Mix  12.5μl

       7.5μM基因引物 2.0μl

       反转录产物  2.5μl

       ddH2O   8.0μl

       2）取0.2ml PCR管，配制如下反应体系，每个反转录产物配制3管。

       2×qPCR Mix  12.5μl

       7.5μM内参引物 2.0μl

       反转录产物  2.5μl

       ddH2O   8.0μl

       3）PCR扩增

       预变性    95℃，10min

       循环（40次）      95℃，15s→60℃，60s

4、结果处理

      ΔΔCT法：

      A=CT(目的基因，待测样本)- CT(内标基因，待测样本)

      B=CT(目的基因，对照样本)- CT(内标基因，对照样本)

      K=A-B

注意事项

      1、长度：15—30bp。

      2、G十c含量：应在40%一60%之间。

      3、碱基分布的随机性

      4、引物自身：最好不要含有自身互补序列，否则会形成发夹样二级结构。

      5、引物之间：两个引物之间不应有多于4个的互补或同源碱基，不然会形成引物二聚体，尤应避免3’端的互补重叠。

      6、上下游引物的互补性：一个引物的3‘末端序列不允许结合到另一个引物的任何位点上。

      7、3’末端：如果可能的话，每个引物的3‘末端碱基应为G或C。

      8、设计RT-PCR的引物时，上下游引物要跨内含子，以消除基因组DNA的干扰。

      9、引物设计好后再NCBI上进行序列比对，检查是否可能有错配产物扩增。

      10、引物设计要注意种属。

       （本文转载小木虫）