荧光定量PCR

一、主要实验步骤如下： 

       1、设计并合成 Realtime PCR 引物。 

       2. 引物溶解后使用 Promega 的 TaqDNA 聚合酶进行含 SG（SYBR®； Green）的 PCR 反应的优化。 

       3. 客户样品 RNA 抽提 。

       a.实验对象为组织样品，取适量（50-100 mg）新鲜组织样品或正确保存的组织样品加 1 ml 的 RNA 抽提试剂Trizol（Invitrogen），匀浆后抽提 RNA。 

       b.实验对象为细胞样品，每份样品取 1×106～1×107 细胞，PBS 清洗细胞，去 PBS 加 1 ml 的 RNA 抽提试剂 Trizol（Invitrogen），裂解后抽提 RNA 。

       4. RNA 质量检测  

       a. 紫外吸收测定法测定 RNA 在分光光度计 260 nm 和 280 nm 处的吸收值，以计算其浓度并评估 RN A纯度 。

       b. 使用甲醛电泳试剂进行变性琼脂糖凝胶电泳，检测RNA纯度及完整性。 

       5. 使用逆转录酶（Promega）进行反应，将样品RNA逆转录为cDNA。 

       6. 制备标准曲线样品： 

       7. 标准曲线样品和待测样品分别加入到含SG的RealTime PCR反应液中，进行RealTime PCR扩增和检测。 

       8. 检测结果进行标准曲线分析：以对待测样品的目的基因进行定量。相对定量实验需要进一步用样品的目的基因测得值除以管家基因测得值以校正误差，所得结果代表某样品的目的基因相对含量。 

       9. 提供实验报告：包括详细的实验方法及实时荧光定量 PCR 实验结果的相关图表 。

二、荧光定量 PCR 中的一些术语

       CT值：荧光信号有统计意义显著增长(即穿过阈值线)时的循环次数，或者说是从基线到指数增长的拐点所对应的循环次数。

       阈值：阈值的默认设置是 3-15 个循环的荧光信号的标准偏差的 10 倍。

CT值与起始模板的量成线性关系。

       （本文转载丁香通）