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慢病毒包装简要步骤及注意事项

慢病毒包装简要步骤

        以六孔板中的1孔为例,每个样品需要1×106个293T细胞。

        1.  取1.5 ml灭菌EP管,加入1.5 μg包装混合质粒和0.5 μg表达质粒以及250 μl的无血清培养基。轻柔混匀,室温孵育5 min。


        2.  取1.5 ml灭菌EP管,取9 μl 脂质体2000 l溶于250 μl无血清培养基中。轻柔混匀,室温孵育5 min。


        3.  将DNA溶液和脂质体溶液轻柔混匀。室温孵育20 min

        4.  用胰酶消化并记数293T细胞。用含血清的培养基重悬细胞。

        5.  在六孔板中每孔,加入1 ml含血清的生长培养基,再加入DNA-脂质体复合物。

        6.  将1 ml重悬的293T细胞(1×106个细胞/ml)加入到平板中。37 ℃ CO2孵箱中孵育过夜。

        7.  移除含有DNA-脂质体复合物的培养基移除,代之以DMEM(含丙酮酸钠和非必须氨基酸)。

        8.  转染后48-72 h收获含病毒的上清。3000 rpm 离心20 min,去除沉淀。

        9.  病毒上清-80 ℃贮存。

        包装出来的慢病毒对NIH/3T3细胞达90%以上感染效率。

注意事项


        1.  在慢病毒感染细胞前,为检测病毒上清培养液内病毒的活性,并确定病毒与转染细胞之间的比率,需要确定病毒的滴度。病毒的滴度可以通过转染Hela细胞,然后使用抗体筛选稳定的细胞转染株,进行计数和数值统计。

        2.  在慢病毒转染细胞的过程中最重要的一步是融合,只有一些较小的慢病毒载体才能转导进细胞,因此,病毒颗粒的吸附是慢病毒转染的限速步骤。


       (本文转载生物帮)



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