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分子生物学技术miRNA

RNA的变性琼脂糖凝胶电泳实验原理、材料和操作步骤
一、实验目的
 
       学习RNA琼脂糖凝胶电泳的使用技术。
 
二、实验原理
 
       RNA可以使用非变性或变性凝胶电泳进行检测。在非变性电泳中,可以分离混合物中不同分子量的RNA分子,凡是无法确定分子量。只有在变性情况下,RNA分子完全伸展,其泳动率才与分子量成正比。


       判断RNA提取物的完整性是进行电泳的主要目的之一。完整的未降解的RNA制品的电泳图谱应可清晰看到18s rRNA、28s rRNA、5s rRNA的三条带,且28s rRNA的亮度应为18s rRNA的两倍。

 
三、材料、试剂及器具
 

      1、 材料


      总RNA提取物。
 

      2、 试剂


     (1)0.1%DEPC水:200ml双蒸去离子水加0.2mlDEPC焦炭酸、二乙酯混匀,室温放置过夜,高压灭菌。


     (2)10x电泳缓冲液。


      吗啉代丙烷磺酸(MOPS) 0.4mol/L(pH 7.0)


      NaAc 0.1mol/L


      乙二胺四乙酸(EDTA) 10mmol/L
 
     (3)50mL变性琼脂糖凝胶(1%)
 

     (4)10x电泳缓冲液 5 mL


      琼脂糖 0.5 g


      0.1%DEPC水 36.5 mL


      加热溶解,稍冷却,加入8.5 mL 37%甲醛。
 
     (5)上样缓冲液:50%甘油,1mmmol/LEDTA,0.4% 溴酚兰,0.4%二甲苯蓝。
 
     (6)甲酰胺(去离子)。
 

      3、器具


      (1)电泳系统


      (2)紫外透视仪

  

四、操作步骤

 
       1、 将制胶用具用70%乙醇冲洗一遍,晾干备用。
 
       2、 制胶:
 
       称取0.5g琼脂糖粉末,加入放有36.5mL的DEPC水的锥形瓶中,加热使琼脂糖完全溶解。稍冷却后加入5mL的10x电泳缓冲液、8.5mL的甲醛。然后在胶槽中灌制凝胶,插好梳子,水平放置待凝固后使用。
 
       3、 加样:
 
       在一个洁净的小离心管中混合以下试剂:电泳缓冲液(10x)2μl、甲醛3.5mL、甲酰胺10mL、RNA样品3.5μl。混匀,置60℃保温10min,冰上速冷。加入3μl的上样缓冲液混匀,取适量加样于凝胶点样孔内。同时点RNA标准样品。
 
       4、 电泳:
 
       打开电泳仪,稳压7.5V/cm电泳。
 
       5、 电泳结束后通过紫外透视仪观察。
 
五、注意事项
 

        本实验中必须保持RNase污染以免RNA降解。所有试剂用DEPC水配制,用具也用DEPC水冲洗,并灭菌。


       (本文转载丁香通)

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